大黄甘草汤通过SIRT3介导的NRF2去乙酰化作用抑制急性肾损伤中的铁死亡

《Phytomedicine》：Dahuang Gancao decoction suppresses ferroptosis via SIRT3-mediated NRF2 deacetylation in acute kidney injury

脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）的肾保护机制研究，通过大黄甘草汤（DHGC）体内体外实验，发现其抑制铁死亡的关键途径为激活SIRT3/NRF2通路，促进NRF2核转位及GPX4表达，并成功筛选出活性成分。

　　

崔梦迪|安毅|赵静玲|慧淼欣|熊志莉|关冰|沈银凤|邹银水|李成银|王瑞

中国武汉湖北中医药大学

摘要

背景

急性肾损伤（AKI）是败血症的主要并发症之一，因此需要探索新的治疗方式。中药大黄甘草汤（DHGC）在治疗败血症相关急性肾损伤（SA-AKI）方面具有潜力。然而，其具体机制仍需进一步研究。

目的

本研究旨在验证DHGC在体内和体外对SA-AKI的抗铁死亡效应。

方法

使用脂多糖（LPS）诱导C57BL/6小鼠和C57BL/6背景sirtuin-3（SIRT3）-/-小鼠，同时使用erastin诱导正常人和si-SIRT3近端肾小管上皮细胞（HK-2）建立铁死亡表型，随后进行DHGC处理。首先通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定DHGC的成分，并通过与高效液相色谱（HPLC）参考标准的比较进一步筛选潜在活性成分。利用生化检测、透射电子显微镜（TEM）、免疫组化和细胞计数试剂盒-8（CCK-8）评估DHGC在体内和体外的铁死亡水平及其保护机制。通过RNA-seq鉴定关键通路，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）和Western blotting进行验证。最后，将潜在活性成分与SIRT3进行分子对接，以选择后续体外功能验证的候选单体。

结果

使用LPS诱导小鼠的SA-AKI，使用erastin诱导HK-2细胞的铁死亡。DHGC改善了肾功能，提高了细胞存活率，并逆转了关键铁死亡指标的异常变化。在机制上，建模后SIRT3/核因子红细胞2相关因子2（NRF2）通路相关蛋白的表达水平下调，NRF2核转位受到抑制；相比之下，DHGC上调了SIRT3/NRF2通路相关蛋白的表达，促进了NRF2的核转位，并激活了下游谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达。重要的是，DHGC在SIRT3缺陷模型中未能改善上述指标。通过HPLC参考标准比较筛选DHGC的潜在活性成分，并通过与SIRT3的分子对接鉴定候选单体。这些单体表现出与母体化合物DHGC一致的抑制铁死亡效应。

结论

本研究首次证明DHGC通过刺激SIRT3驱动的NRF2去乙酰化、促进NRF2核转位和抑制铁死亡来延缓SA-AKI的进展。这些发现表明DHGC是SA-AKI的潜在治疗候选药物，值得进一步临床研究。

引言

急性肾损伤（AKI）是败血症的常见并发症，超过50%的败血症患者会出现这种情况，对其生存构成重大威胁。流行病学数据显示，败血症相关急性肾损伤（SA-AKI）的发病率为32%，这与其院内死亡率相当（White等人，2023年）。幸存者可能会发展为慢性肾病甚至终末期肾病（Fiorentino等人，2024年）。尽管支持性疗法有所进展，但SA-AKI的临床负担仍然存在。

铁死亡被认为是SA-AKI的关键驱动因素（Lin等人，2023年）。细胞内铁过载是铁死亡的特征，铁死亡伴随着活性氧的过度积累、线粒体结构损伤（如线粒体萎缩和嵴结构破坏）以及膜脂质过氧化（Dixon等人，2012年）。在败血症条件下，肾小管上皮细胞中的铁代谢紊乱导致铁过载，从而通过Fenton反应产生活性氧（ROS）（Sato等人，2018年）。这种级联反应导致膜结构内脂质过氧化物的积累，引发细胞膜破裂和程序性细胞死亡，最终导致AKI（Park等人，2019年）。虽然这些病理作用已在多种AKI模型中得到证实，但其确切机制和治疗靶点仍需进一步阐明（Zhou等人，2019年）。

中医在肾脏疾病的管理中具有独特的治疗优势，在中国已有2000多年的应用历史（Wang等人，2021年）。大黄甘草汤（DHGC）由大黄（Rheum palmatum L）和甘草（Glycyrrhiza uralensis）组成，首次记载于《伤寒杂病论》中。根据中医理论，DHGC具有清除湿热毒素和促进血液循环的作用，这表明它可能对SA-AKI具有治疗效果。我们之前的研究表明DHGC能够有效缓解SA-AKI的进展（Wang等人，2023年）。药理学研究证实，DHGC的关键生物活性成分如大黄素可以通过抑制ROS积累、增加超氧化物歧化酶（SOD）活性和上调核因子红细胞2相关因子2（NRF2）表达来减轻脂质过氧化（Zhuang等人，2019a）。大黄素通过NRF2介导的谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达上调来抑制铁死亡（Ji等人，2023a）。总体而言，这些发现表明DHGC可能通过调节铁死亡发挥多靶点保护作用。

在铁死亡过程中，线粒体不仅是脂质过氧化的主要场所，也是细胞内铁稳态的核心调节器（Huan等人，2024年）。线粒体内铁平衡的破坏直接增加细胞对铁死亡的敏感性；因此，维持线粒体稳定性成为关键的治疗目标。值得注意的是，sirtuin 3（SIRT3）作为线粒体氧化还原稳态和能量代谢的关键调节因子，可能为DHGC的肾保护机制提供新的视角。作为线粒体定位的NAD?依赖性去乙酰酶，SIRT3通过减轻线粒体氧化损伤发挥肾脏保护作用（Zhang等人，2020年）。同时，NRF2通过激活抗氧化蛋白（如GPX4）来维持氧化还原稳态（Kawai等人，2011年）。最近的研究表明，SIRT3通过去乙酰化增强NRF2的活性，从而促进NRF2的核转位并激活下游抗氧化蛋白的表达（Zhao等人，2024年）。我们之前的研究表明，SIRT3/NRF2轴参与了DHGC对抗SA-AKI的治疗效果（Wang等人，2023年）。因此，我们提出DHGC可能通过激活SIRT3/NRF2通路来缓解SA-AKI中的铁死亡。本研究旨在验证DHGC是否通过SIRT3/NRF2通路调节来提供肾脏保护。此外，本研究还旨在阐明SIRT3去乙酰化NRF2的具体机制，为SA-AKI的治疗干预提供新的见解。

试剂

脂多糖（LPS）购自Solarbio（L8880–10，北京，中国）。Elastin（E424821）和色谱级甲酸购自Aladdin Biochemical Technology（上海，中国）。Ferrostatin-1（Fer-1）（RM02804）由ABclonal Biotechnology（武汉，中国）提供。大黄素（B20245）购自Orileaf（上海，中国）。地塞米松磷酸钠注射液（H42020019）购自天津Kingyork集团湖北天耀药业有限公司（湖北，

基于LC-MS/MS的DHGC成分鉴定

通过LC-MS/MS分析鉴定出DHGC的成分，如图1-A和B所示。表S2和S3提供了按正负离子模式下峰面积排名的前20种生物活性化合物的详细列表。代表性化合物包括柠檬酸、大黄素、18-β-甘草酸和芦荟大黄素。此外，还进行了HPLC参考标准比较，以进行主要生物活性成分的定性和定量测定

讨论

SA-AKI是败血症的严重并发症之一，其特征是炎症、氧化应激和铁死亡（Chen等人，2018年；Xiao等人，2024年）。这些病理特性可能导致不可逆的肾脏损伤，并显著增加发展为慢性肾病（CKD）的风险（Fiorentino等人，2024年）。因此，预防和治疗SA-AKI至关重要。DHGC在SA-AKI中具有特定的治疗潜力，值得进一步研究。

结论

总之，本研究结果表明，DHGC通过激活SIRT3介导的NRF2去乙酰化、促进NRF2核转位来减轻铁死亡（图8）。这些观察结果表明，SIRT3/NRF2通路是SA-AKI的一个有前景的治疗靶点，并提供了支持DHGC治疗潜力的临床前数据。

CRediT作者贡献声明

崔梦迪：撰写——初稿，资源准备，概念构思。安毅：验证，方法学，研究。赵静玲：验证，方法学，研究。慧淼欣：撰写——初稿，验证，研究，数据管理。熊志莉：方法学，研究。关冰：方法学，研究。沈银凤：验证，研究，数据管理。邹银水：验证，资源准备，方法学。李成银：撰写——初稿，资源准备，项目协调。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

国家自然科学基金（82405273），湖北省自然科学基金创新与发展联合基金项目（2024AFD299、2022CFD023和2025AFD478）。2025至2026年湖北省中医药管理局的中医药研究项目（ZY2025L243、ZY2025M031和ZY2025M016）。武汉中医药研究项目，编号：WZ24Q05。所有作者感谢所有提供帮助和意见的人士