《Redox Biology》：Redox-Modulating Macrophage Biohybrid Nanoplatform for Targeted RIPK1-PANoptosome Suppression in Ischemic Stroke
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本研究针对缺血性脑卒中再灌注期间氧化应激触发复杂神经炎症级联反应的临床难题，开发了一种MRI可追踪的工程化巨噬细胞生物杂交纳米平台（MA@ULips）。该平台整合了巨噬细胞的炎症靶向能力、超小超顺磁性氧化铁纳米颗粒的成像功能以及TEMPO掺杂脂质的氧化还原调节活性，通过清除活性氧（ROS）和抑制RIPK1介导的PANoptosome形成，显著抑制PANoptosis（一种整合了细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的程序性细胞死亡方式），有效改善神经元存活并促进神经功能恢复。该研究为缺血性脑卒中的精准诊疗提供了新型多功能纳米治疗策略，对神经炎症相关疾病的治疗具有重要参考价值。
缺血性脑卒中（Ischemic Stroke）是全球范围内导致残疾和死亡的主要原因之一，给社会带来沉重的公共卫生负担。尽管溶栓和机械取栓等现有治疗策略能够有效恢复血流，但由于狭窄的治疗时间窗限制，仅有不到5%的急性缺血性脑卒中患者能够及时接受干预。更为严峻的是，即使成功进行了血运重建，许多患者仍因卒中后神经炎症（Post-stroke Neuroinflammation）而遭受长期的神经功能缺损。这一炎症级联反应主要由活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）驱动，涉及小胶质细胞和星形胶质细胞的激活以及促炎细胞因子的分泌。传统的抗炎药物由于血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）穿透性差、脱靶效应和治疗效果有限，其临床应用受到很大限制。近年来，基于纳米颗粒的药物递送系统显示出潜力，但其应用常因血液循环时间短和靶点药物积累不足而受阻。与此同时，基于活细胞的药物递送系统作为有前景的替代方案脱颖而出，其优势包括增强的精准靶向、跨越BBB等生物屏障的能力以及个性化治疗的潜力。在众多细胞类型中，免疫细胞因其固有的穿越BBB、定位至炎症组织以及逃避免疫清除的能力而受到广泛关注。巨噬细胞（Macrophages）作为炎症反应和组织修复过程的关键参与者，能够响应炎症信号被募集至损伤部位，通过趋化性介导组织修复。利用其天然靶向能力，工程化巨噬细胞可以作为有效的载体，将治疗剂精确递送至缺血脑组织，从而提高卒中治疗的疗效。
然而，传统的神经保护策略通常聚焦于单一的细胞死亡通路，如细胞焦亡（Pyroptosis）、细胞凋亡（Apoptosis）或特定的抗炎机制，这可能不足以应对卒中后神经炎症复杂、多因素交织的特性。一种更具前景的策略是靶向PANoptosis（潘诺普托西斯），这是一种新近定义的程序性细胞死亡形式，其在PANoptosome复合物的调控下整合了细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡（Necroptosis）。PANoptosis为多种程序性细胞死亡通路提供了一个汇聚点，代表了管理缺血性脑卒中炎症和细胞死亡的新策略。此外，磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）因其非侵入性、高空间分辨率、深部组织穿透能力以及相对较长的造影剂滞留时间，已成为临床前和临床研究中细胞追踪的宝贵技术。
为了应对上述挑战，发表在《Redox Biology》上的这项研究，开发了一种炎症激活的工程化巨噬细胞衍生的MRI可追踪生物杂交纳米平台（MA@ULips），旨在调节多通路细胞死亡抑制，为缺血性脑卒中提供精确的治疗策略。研究人员通过将巨噬细胞（MA）与膜结构化的、负载磁性纳米颗粒的脂质体（ULips）共孵育，构建了MA@ULips系统。该系统整合了超小超顺磁性氧化铁（Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide, USPIO）纳米颗粒（便于MRI细胞追踪）和2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基（2,2,6,6-Tetramethylpiperidine-1-oxyl, TEMPO）（既作为ROS清除剂，也作为受体相互作用蛋白激酶1（Receptor-interacting Protein Kinase 1, RIPK1）介导的PANoptosome复合物形成的抑制剂）的优势。
为开展研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：1) 纳米材料合成与表征：通过热分解法合成USPIO，并通过薄膜水化法制备负载USPIO和TEMPO修饰脂质（DOPE-PEG2000-TEMPO）的脂质体（ULips），利用透射电子显微镜、动态光散射、X射线光电子能谱等技术对其形貌、尺寸、电位及晶体结构进行表征。2) 细胞工程化与功能验证：通过膜融合机制将ULips与RAW 264.7巨噬细胞共孵育制备MA@ULips，并评估其细胞活力、融合效率、迁移能力及体外血脑屏障穿透性。3) 体外疾病模型构建与机制探索：利用过氧化氢（H2O2）诱导的PC12细胞氧化损伤模型和氧糖剥夺/再灌注（Oxygen Glucose Deprivation/Reoxygenation, OGD/R）细胞模型，评估MA@ULips的ROS清除能力、抗细胞死亡（包括凋亡、焦亡、坏死性凋亡及PANoptosis）效应以及对小胶质细胞极化的调节作用，并通过蛋白质印迹、免疫荧光、流式细胞术等手段分析相关蛋白表达。4) 体内动物模型评估：建立小鼠短暂性大脑中动脉闭塞/再灌注（Middle Cerebral Artery Occlusion/Reperfusion, MCAO/R）模型，通过体内荧光成像、MRI、TTC染色、行为学测试、组织病理学分析和RNA测序等技术，系统评价MA@ULips的靶向性、神经保护效果、安全性及其对神经炎症微环境的调节作用。
3.1. MA@ULips的制备与表征
研究人员成功合成了粒径均匀（3-6 nm）的USPIO纳米颗粒，并将其封装于由DOPE、DOTAP和DOPE-PEG2000-TEMPO组成的脂质壳中，形成ULips。表征结果显示ULips具有明确的球形形态和良好的稳定性。通过将ULips与巨噬细胞共孵育，实现了基于膜融合的MA@ULips构建。细胞毒性实验表明ULips对巨噬细胞无明显毒性，融合效率高（2小时可达99.4%）。共聚焦显微镜和生物透射电镜证实ULips主要定位于巨噬细胞膜和胞质区域。MRI体外 phantom 实验表明MA@ULips具有高的横向弛豫率（r2= 39.48 mM?1s?1），显示出良好的T2加权MRI对比增强潜力。
3.2. ULips的ROS清除活性
研究人员系统评估了ULips的抗氧化能力。结果表明，ULips能有效清除ABTS•+、DPPH•、PTIO•等多种自由基。此外，ULips表现出类过氧化氢酶（Catalase, CAT）活性，能催化H2O2分解产生O2；同时具备清除羟基自由基（•OH）和类超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）活性，能中和超氧阴离子自由基（•O2?）。这些结果证实ULips具有强大的多重ROS清除能力，为其在氧化应激相关疾病中的应用奠定了基础。
3.3. 通过ROS清除和抑制RIPK1介导的PANoptosome实现神经保护
通过建立体外血脑屏障模型和PC12细胞氧化损伤模型，研究发现MA@ULips能有效穿越血脑屏障并靶向炎症部位。MA@ULips处理显著降低了H2O2或OGD/R诱导的PC12细胞内ROS水平，减少了细胞凋亡，改善了线粒体膜电位，降低了细胞内钙离子浓度，从而提高了细胞活力。机制研究表明，MA@ULips能下调PANoptosis关键蛋白的表达，包括凋亡相关蛋白caspase-8，焦亡相关蛋白NLRP3、ASC和caspase-1，以及坏死性凋亡关键蛋白RIPK1。特别重要的是，免疫共沉淀实验证实MA@ULips能抑制RIPK1-RIPK3-ASC复合物的形成，并降低磷酸化RIPK1和磷酸化MLKL的水平。使用RIPK1抑制剂Nec-1s进行的实验进一步支持了MA@ULips通过靶向RIPK1-PANoptosome轴发挥神经保护作用的结论。
3.4. 小胶质细胞表型调控与神经炎症减轻
研究发现，MA@ULips能够调节小胶质细胞的极化状态。在脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）或OGD/R诱导的炎症环境下，MA@ULips处理促进了小胶质细胞从促炎的M1表型（CD86+）向抗炎的M2表型（CD206+）转化。酶联免疫吸附试验结果显示，MA@ULips降低了促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）和白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）的水平，同时提高了抗炎细胞因子白细胞介素-10（Interleukin-10, IL-10）和精氨酸酶-1（Arginase-1, Arg-1）的水平，表明其能有效缓解神经炎症。
3.5. MA@ULips在缺血性脑卒中中的体内靶向能力、炎症追踪及治疗效果研究
在MCAO/R小鼠模型中，体内荧光成像和MRI显示MA@ULips能高效靶向并积聚于脑缺血区域。生物安全性评价表明MA@ULips具有良好的血液相容性和组织相容性，未引起显著的全身毒性。治疗结果显示，MA@ULips能显著减小脑梗死体积，减轻脑水肿，改善神经功能缺损评分，并提高小鼠的生存率和体重恢复。行为学测试（圆筒实验、旷场试验、改良神经严重程度评分）证实MA@ULips治疗能显著促进运动、感觉和反射功能的恢复。组织学分析（尼氏染色、H&E染色、TUNEL染色）表明MA@ULips能减少神经元损伤和细胞凋亡。免疫组织化学和免疫荧光染色显示MA@ULips治疗降低了星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）的表达和小胶质细胞标志物离子钙接头蛋白分子1（Ionized Calcium-Binding Adapter Molecule 1, Iba-1）及CD86的表达，同时促进了神经元核抗原（Neuronal Nuclei, NeuN）和微管相关蛋白2（Microtubule-Associated Protein 2, MAP2）的表达，进一步证实了其神经保护作用和抗炎效果。
3.6. 增强神经功能恢复及调节缺血炎症微环境
行为学研究的综合结果一致表明，MA@ULips治疗能显著改善MCAO/R小鼠的神经功能结局，包括降低前肢使用不对称率、增加旷场中的运动距离以及降低mNSS评分。血清和脑组织炎症因子检测表明，MA@ULips能系统性调节炎症反应，降低促炎因子IL-6，提升抗炎因子IL-10。
3.7. MA@ULips对缺血性脑卒中的治疗机制
RNA测序分析为MA@ULips的作用机制提供了基因组学证据。差异表达基因分析显示，MCAO/R损伤激活了与炎症反应、细胞死亡相关的多个通路，而MA@ULips治疗则显著下调了这些通路。基因集富集分析证实了MA@ULips对凋亡、坏死性凋亡、NF-κB信号通路、NOD样受体通路和Toll样受体通路的抑制作用。蛋白质-蛋白质相互作用网络和基因相关性分析进一步强调了PANoptosis相关通路在缺血损伤中的核心地位，以及MA@ULips通过调节ROS相关基因和PANoptosis相关基因发挥治疗作用。
本研究成功开发了一种多功能、MRI可追踪的工程化巨噬细胞生物杂交纳米平台（MA@ULips），用于缺血性脑卒中的治疗。该平台巧妙地将巨噬细胞的炎症靶向能力、USPIO纳米颗粒的MRI成像功能以及TEMPO的氧化还原调节和PANoptosis抑制活性整合于一体。研究证实，MA@ULips能够高效靶向缺血脑组织，通过清除ROS和抑制RIPK1-PANoptosome通路，有效抑制PANoptosis（整合了细胞焦亡、凋亡和坏死性凋亡的程序性细胞死亡），调节小胶质细胞向抗炎M2表型极化，从而减轻神经炎症，促进神经元存活和神经功能恢复。体内外实验均证明了其良好的生物安全性、显著的神经保护作用和治疗潜力。该研究不仅为缺血性脑卒中的精准治疗提供了一种创新的协同治疗策略，揭示了靶向氧化应激-PANoptosis轴的重要性，而且其平台技术也具有应用于其他氧化应激和炎症相关疾病的广泛前景，为神经系统疾病的纳米治疗学发展提供了新的思路和方向。
