一种基于1H核磁共振（NMR）的新型定量方法，用于直接测定单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的含量

《Talanta》：A novel 1H NMR-based quantitative method for the direct quantification of mono-rhamnolipids and di-rhamnolipids

基于1H NMR的高效定量分析方法用于复杂混合物中单糖脂和双糖脂的同步测定，解决了传统方法依赖高纯度标准品和结构分析局限的问题。该方法通过优化混合溶剂体系（DMSO-d6/CD3OD 4:1）和采用苯甲酸钠作为内标，实现了低至5%相对丰度的检测限和<2%的重复性误差，有效提升了糖脂类生物表面活性剂的分析效率和标准化水平。

　　

李东梅|兰贤发|陶伟毅|林俊章|陈志辉|李双

南京工业大学生物技术与制药工程学院，南京，211816，中国

摘要

鼠李糖脂是一种环保型生物表面活性剂，具有广泛的应用前景；然而，其结构复杂性以及高纯度标准品的有限可用性给分析工作带来了显著挑战。在本研究中，我们开发了一种基于¹H NMR的方法，用于直接定量复杂混合物中的单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。通过识别特征性质子信号并优化混合氘代溶剂系统（DMSO–d₆/CD₃OD，4:1 v/v），使用钠p-羟基苯甲酸盐作为内标，实现了准确的定量。该方法表现出强大的抗干扰能力、优异的重现性（RSD <2 %）、高准确性（相对误差 <5 %）以及5 %的相对丰度检测限，并且 spiked样品的回收率令人满意，从而克服了传统分析技术的局限性。这种方法无需高纯度参考标准品，简化了样品制备过程，为鼠李糖脂的研究和工业质量控制提供了一种可靠且高效的方法。

引言

鼠李糖脂是一类由微生物合成的生物表面活性剂，具有高表面活性、低毒性和优异的生物降解性[[1], [2], [3]]。它们在日用化学品、石化、环境修复和生物医学等多个领域具有广泛的应用潜力，目前正处于市场推广阶段[4,5]。

鼠李糖脂是一类糖脂类生物表面活性剂，通常以复杂的混合物形式存在，具有多种分子结构。这些化合物的结构特征是一个或两个L-鼠李糖基团连接到一个或两个长度可变的β-羟基脂肪酸链上，这些脂肪酸链可以是饱和的或不饱和的[6,7]。迄今为止，已鉴定出超过60种不同的鼠李糖脂结构变体[8]。根据所含鼠李糖单元的数量，鼠李糖脂可以系统地分为两大类：单鼠李糖脂和双鼠李糖脂[9,10]。某些细菌菌株，如Burkholderia属菌株，主要产生长链鼠李糖脂（例如Rha-Rha-C₁₄-C₁₄）[6,11]；然而，Pseudomonas aeruginosa被认为是鼠李糖脂的主要生产者，通常生成主要成分Rha-C₁₀-C₁₀和Rha-Rha-C₁₀-C₁₀[12]。

随着鼠李糖脂从学术研究走向应用市场，对其的定量分析方法变得不可或缺。蒽酮-硫酸法仍是目前最常用的鼠李糖脂定量技术。然而，不同研究中用于将鼠李糖含量与鼠李糖脂浓度关联的转化系数（例如3.4、3.0、2.22、2.74）存在差异，导致实验室间结果的可比性和重现性较差[[13], [14], [15]]。高效液相色谱联用蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）被广泛认为是一种相对准确的鼠李糖脂定量方法[16]；然而，这种方法高度依赖于高纯度鼠李糖脂标准品的可用性。由于来自不同来源的鼠李糖脂样品在结构成分上的差异[4]，以及对其结构和功能研究的深入，不仅需要准确测定总鼠李糖脂含量，还需要确定其各个结构组分。因此，建立一种可靠的单鼠李糖脂和双鼠李糖脂定量分析方法对于表征不同鼠李糖脂样品的差异、优化微生物发酵过程以及开发功能性产品至关重要。

在商业化的鼠李糖脂产品中，Rha-C₁₀-C₁₀和Rha-Rha-C₁₀-C₁₀是主要成分，代表了单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的典型结构。本研究旨在开发一种基于¹H NMR的直接定量方法，用于同时测定复杂样品中的单鼠李糖脂（Rha-C₁₀-C₁₀）和双鼠李糖脂（Rha-Rha-C₁₀-C₁₀）。通过对这两种鼠李糖脂的¹H NMR光谱特征进行系统分析，并优化氘代溶剂组成和内标系统，成功建立了一种新的分析方法，实现了无需鼠李糖脂参考标准品的快速和绝对定量。该方法在抗干扰能力、重复性、准确性、相对丰度检测限和抗干扰性方面都经过了严格评估，表现出优异的精确度和可靠性。这项研究为各种应用中鼠李糖脂的准确定量分析提供了有价值的技术策略和理论基础。

部分内容摘录

单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的柱层析纯化

本研究中使用的鼠李糖脂由Pseudomonas aeruginosa YM4（CCTCC编号：M2017494）产生。如前所述，发酵过程中使用大豆油作为碳源[16]。YM4菌株主要合成了两种鼠李糖脂：Rha-C₁₀-C₁₀和Rha-Rha-C₁₀-C₁₀。发酵结束后，将发酵液在7000×g下离心5分钟以去除细菌细胞。所得上清液用H₂SO₄酸化至pH 2.0，然后在4°C下保存12小时以诱导

通过柱层析纯化鼠李糖脂

含有超过90%水分的YM4菌株发酵液经过处理后得到黄色粗提物。进一步通过柱层析纯化后得到白色、纯净的鼠李糖脂，如图1(a)所示。如图1(b)的层析分析所示，粗提物（A道）是单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的混合物，通过柱层析分离得到了高纯度的单鼠李糖脂（B道）和双鼠李糖脂（C道）。

结论

本研究建立并验证了一种基于¹H NMR的鼠李糖脂定量方法，能够快速同时定量单鼠李糖脂和双鼠李糖脂。该方法表现出强大的抗干扰能力、优异的重现性（RSD <2 %）、高准确性（相对误差 <5 %）以及5 %的相对丰度检测限，最重要的是，它克服了对鼠李糖脂标准品的依赖性。

CRediT作者贡献声明

李东梅：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，实验研究。兰贤发：撰写 – 初稿，实验研究，正式分析。陶伟毅：正式分析，数据管理。林俊章：方法学研究，实验研究。陈志辉：正式分析。李双：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划（项目编号：2022YFC2105200）的支持。