通过LC×LC-荧光技术进行全面的化学指纹分析，并结合数据驱动的化学计量建模来实现无监督分类

《Talanta》：Comprehensive chemical fingerprinting by LC×LC-fluorescence and data-driven chemometric modelling for unsupervised classification

新型 ruthenium-based 红ox 介体通过分子对接筛选并电聚合固定，构建低电位高灵敏度葡萄糖传感器，21天稳定性良好，简化 CGM 生产流程。

　　

曹文婷|王浩天|张学智|王永忠|金晓峰

安徽大学生命科学学院，合肥，230601，中国

摘要

目前的连续葡萄糖监测（CGM）技术通常需要复杂的制造工艺，导致供应成本较高。因此，迫切需要开发一种可靠且成本效益高的连续葡萄糖监测替代方案。作为基于电化学技术的CGM的核心技术，氧化还原介质材料直接影响产品的安全性和可靠性。然而，适用于商业可行CGM系统的氧化还原介质选择极为有限，这凸显了通过合理设计开发新型氧化还原介质材料的紧迫性。传统的葡萄糖氧化酶（GOx）和介质固定化技术无法适应连续操作条件，而且固定的介质可能会出现泄漏问题，从而导致稳定性降低，严重限制了其在CGM中的应用。本文通过分子对接方法，发现了一种有前景的基于钌的氧化还原介质。制备的氧化还原介质和GOx通过导电聚合物的一步电聚合实现了固定。所制备的葡萄糖传感器具有2至22 mM的线性检测范围和17.81 μA mM^?1 cm^?2的灵敏度。该传感器在体外可保持长达21天的长期稳定性。本研究提出的策略为商业CGM提供了一个极具吸引力的工具，并展现出巨大的实际应用潜力。

引言

近年来，连续葡萄糖监测（CGM）作为糖尿病精准医疗的潜在范例，受到了广泛关注[[1], [2], [3], [4]]。其监测模式在揭示血糖状态和协助疾病管理方面具有显著优势[[5], [6], [7], [8]]。在CGM的设计中，成本效益高的传感器制造是一个关键考虑因素。然而，现有的可穿戴CGM生物传感器技术往往需要复杂的制造程序，导致供应成本较高。例如，物理吸附方法会导致酶固定化过程中的问题，如酶容易脱落和稳定性差[9]，而纳米材料辅助的固定化方法涉及复杂的修饰步骤，使得传感器制备相对耗时且成本较高[10]。因此，迫切需要开发一种可靠且低成本的CGM替代技术。目前基于酶的葡萄糖传感器的进步主要依赖于氧化还原介质，这些介质能够促进酶与电极之间的电子转移，同时降低施加的电位。这种方法通过消除生物活性因子（如尿酸、抗坏血酸）在真实生物基质中的干扰，减轻了活性分子相互作用带来的问题[11]。例如，雅培糖尿病护理公司的Freestyle Navigator传感器采用了“有线酶”技术，使用基于锇的介质作为电子受体，并将其与葡萄糖氧化酶（GOx）结合。此外，先前的研究还展示了特定氧化还原介质（如四硫富瓦烯（TTF）和铁茂衍生物）的应用[12,13]。然而，这些研究通常仅基于有限的介质材料进行电子转移参数的实验评估，缺乏深入的结构-活性关系研究。作为CGM的核心技术，氧化还原介质材料直接影响葡萄糖传感器的安全性和可靠性。目前适用于商业可行CGM系统的氧化还原介质范围极为有限，因此迫切需要开发新型的计算模型驱动的氧化还原介质材料。作为第八族过渡金属，钌（Ru）通常表现出+2和+3的氧化态，具有优异的催化活性、显著的氧化还原能力和有趣的生物特性[[14], [15], [16]]。研究表明，可以从适当的钌盐溶液中电沉积钌到碳表面上[17]。由此产生的钌位点能够高效且选择性地催化酶反应过程中释放的过氧化氢的电化学还原。这一特性使得基于钌的材料在电化学生物传感应用中特别有前景。

电聚合技术可以精确控制薄膜厚度，从而在聚合过程中形成均匀的靶标生物标志物结合位点[18,19]。聚吡咯（PPy）是一种导电聚合物，具有优异的机械性能和高电导率[20,21]。对于葡萄糖传感器，PPy可作为GOx的有效固定基质[22]。在中性条件下电聚合的PPy-GOx薄膜具有良好的生物相容性。在pH 7时，GOx分子表面的羧基带有负电荷，使葡萄糖氧化酶能够作为PPy的掺杂剂，并在电聚合过程中被捕获在PPy薄膜中[23]。这种方法减少了由于吸附或交联引起的酶分子构象变形，从而保持了高催化活性。近年来，仿生设计为解决传感器的性能瓶颈提供了创新思路[24]。柔性葡萄糖传感器利用仿生灵感，克服了刚性传感器的局限性，同时在可穿戴性和检测性能方面实现了提升。

在这里，我们通过分子对接系统筛选了四种市售的基于钌的复合物，并通过实验验证了它们作为氧化还原介质的可行性。基于钌的氧化还原介质与GOx和PPy在柔性双面针电极上共电聚合，构建了一步法葡萄糖传感器，实现了低电位测量。这种方法大大简化了酶固定的复杂过程，从而实现了高效且成本效益高的葡萄糖传感器制造，降低了生产成本。此外，这种传感器的成功制备为商业CGM提供了新的见解，显著缩短了制造过程，并展示了巨大的实际应用潜力。

试剂

葡萄糖氧化酶（GOx，EC 1.1.3.4，来自曲霉菌属，121 Umg^?1）由Toyobo有限公司（日本）提供。吡咯（Py，99%）和四种市售的钌（Ru）复合物：Ru(bpy)₃²⁺（≥98%）、[Ru(dtbbpy)₃](PF6)₂（≥95%）、[Ru(bpz)₃][PF₆]₂（95%）和[Ru(bpm)₃]Cl₂（95%）由源叶公司（上海，中国）购买。N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、四氢呋喃（THF）、抗坏血酸（AA）、甘氨酸（Gly）、尿酸（UA）、戊二醛（GA）和葡萄糖（Glu）均由Aladdin有限公司购买。

分子对接研究

为了研究小分子活性成分与蛋白质靶标之间的相互作用，使用MOE 2019软件进行了分子对接（图1）。对接研究提供了关于配体与GOx氨基酸残基之间相互作用类型和数量的信息[29]。根据结合结果，表1展示了几种钌复合物与GOx的相互作用结果。具体而言，[Ru(bpz)₃][PF₆]₂的结构模型发生了分子间断裂。

结论

本研究通过合理设计策略，鉴定出一种新型的基于钌的氧化还原介质。所选的氧化还原介质与GOx和PPy一步共电聚合，构建了一种抗干扰葡萄糖传感器，实现了低电位、高灵敏度、高可靠性和低成本检测。所提出的传感器表现出优异的全面性能，可与最近报道的连续葡萄糖监测（CGM）系统相媲美（表S1）[48,49]

CRediT作者贡献声明

曹文婷：撰写——原始草稿，研究。王浩天：可视化，研究，形式分析。张学智：验证，方法学，概念化。王永忠：撰写——审稿与编辑，可视化，验证，概念化。金晓峰：撰写——审稿与编辑，验证，方法学，研究，资金获取，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢安徽大学的科学研究启动基金（S020318003/013）和安徽省研究生联合培训基地的建设资金（Z010110038）的资助。