Calcin蛋白中的保守区域氨基酸突变：改变了RyR蛋白的结构与功能关系

《Toxicology Reports》：Conserved region amino acid mutations in Calcin: Altering the RyR structural-functional relationship

Calcin通过稳定Ryanodine受体（RyR）亚导通态抑制病理钙火花，本研究针对OpiCa1中关键酸性残基E12和E29进行电荷反转突变（R/K），结合计算模拟与细胞实验，发现E29R突变体因增强与RyR酸性通道静电互补，显著提升激活RyR2和诱导心肌细胞钙释放活性，为设计靶向RyR疾病的新型肽类药物奠定基础。

　　

连波 王 | 小雨 花 | 小芬 马 | 建国 王 | 李 小 | 石敏 王 | 姜浩 刘 | 杨飞 赵 | 赫克托·H·瓦尔迪维亚 | 梁 小 | 金明 王

山西农业大学兽医学院，中国太原市，030801

摘要

从蝎子毒液中提取的肽类物质Calcin是一种高亲和力的瑞安尼丁受体（RyRs）配体，已知可以通过稳定亚传导状态来调节钙离子的释放。虽然之前的丙氨酸扫描突变实验强调了静电相互作用的重要性，但将其保守区域内的酸性残基转变为碱性残基的功能影响尚未得到充分研究。在这里，我们采用计算和实验相结合的方法，研究了OpiCa1（一种强效的Calcin成员）中两个酸性位点（E12和E29）的电荷反转突变对其结构、与RyR的相互作用以及功能效果的影响。结果表明，尽管所有突变体（E12R、E12K、E29R、E29K）都保持了天然的抑制性半胱氨酸结折叠结构，但它们的表面电势发生了变化。分子对接和动力学模拟显示，这些突变体与RyR1和RyR2的结合模式和稳定性也有所不同。值得注意的是，E29R突变体在细胞实验中的表现更为优异，通过与RyR2的激活，能够比野生型OpiCa1和其他突变体诱导出更强的Ca²⁺释放。我们的发现表明，E29是一个关键残基，电荷反转突变能够通过增强与RyR酸性通道孔道的静电互补性来优化Calcin的活性。这项研究为Calcin的结构-功能关系提供了重要的见解，并为针对RyR相关钙调节紊乱疾病的肽类治疗剂的合理设计奠定了基础。

引言

Calcin是一类从蝎子毒液中分离出来的碱性肽类，能够特异性地与瑞安尼丁受体（RyRs）相互作用并调节其活性（Belevych等人，2013年；Andersson等人，2011年）。这类肽通常由33-35个氨基酸组成，具有紧凑的球状构象，并通过三个二硫键形成的抑制性半胱氨酸结（ICK）基序得以稳定（Woll和Van Petegem，2022年）。值得注意的是，Calcin序列中含有三个富含赖氨酸和精氨酸残基的保守区域。这些碱性残基在分子的一个半球上聚集，形成了一个明显的正电荷斑块，这是其与RyR中心通道域内富含酸性残基的S6螺旋发生特异性静电相互作用的结构基础（Woll和Van Petegem，2022年；Jaque-Fernandez等人，2023年）。

瑞安尼丁受体（RyRs）是位于肌浆网/内质网上的大型细胞内钙离子释放通道，在骨骼肌和心肌的兴奋-收缩耦合中起着关键作用（Kim等人，2017年；Xiao等人，2016年）。它们的功能对于将电信号转化为机械收缩至关重要（Lanner等人，2010年）。RyRs的功能障碍会导致细胞内Ca²⁺平衡紊乱，这与多种心脏疾病（包括心律失常和心力衰竭）密切相关（Uthayabalan等人，2024年；Hua，2024年）。因此，通过精确调节RyRs的 gating行为来治疗相关疾病具有重要的治疗潜力（Van Petegem，2012年；Gillis和Dobrev，2022年）。

从功能上讲，Calcin可以使RyRs进入稳定的亚传导状态，从而抑制病理性舒张期Ca²⁺泄漏，同时保持生理性的Ca²⁺瞬变（Dridi等人，2023年；Matsukawa和Murayama，2023年）。这一特性使其成为调节病理性Ca²⁺泄漏的潜在治疗靶点。之前的定向突变研究表明：用中性丙氨酸替换Calcin中的酸性残基可以增强其与RyR的结合能力，而将碱性残基突变为丙氨酸则会降低其活性（Seo等人，2026年；Vargas-Jaimes等人，2017年）。这强烈表明静电相互作用是Calcin与RyR结合的关键驱动力。

然而，以往的研究主要集中在消除负电荷（通过突变为丙氨酸）的效果上。直接将酸性残基转变为碱性残基的功能后果仍大多未被探索（Seo等人，2026年；Yao等人，2024a）。这种“电荷反转”策略有望最大化与RyR酸性通道孔道的静电互补性，可能对结合亲和力、动力学和最终功能效果产生更深远的影响。此外，酸性残基的功能重要性是否取决于它们在不同保守区域内的位置，还有待进一步阐明。

基于这一背景，我们选择了Calcin家族中最活跃的成员OpiCa1作为研究模板。本研究旨在系统地探讨将其保守区域内的关键酸性残基（E12和E29）转变为碱性残基（精氨酸或赖氨酸）对其结构、与RyRs（包括RyR1和RyR2）的结合稳定性以及调节心肌细胞中Ca²⁺释放效果的影响。通过结合计算模拟（分子对接和动力学）和细胞功能实验，我们希望阐明Calcin与RyR之间“电荷-构象”协同作用的复杂机制。这项工作有望为设计高度特异性和强效的Calcin衍生肽类治疗剂提供理论基础，以针对RyR相关疾病。

合成与纯化

OpiCa1及其突变体最初是通过Fmoc固相合成方法合成的线性肽（Janicek等人，2021年；Granzow和Wilson，1972-1973年）。随后在室温下使用95%的TFA溶液处理3小时进行切割，然后用5%的醋酸提取并真空干燥。之后加入折叠缓冲液（20 mM Na₂HPO₄、0.1 mM NaCl、5 mM GSH和0.5 mM GSSG），以促进线性肽的环化。

OpiCa1及其突变体的合成与表征

OpiCa1是一种由33个氨基酸组成的碱性肽，具有碱性特征。其序列中分布着高度保守的碱性残基簇（8KRCK11、19KKCKRR24和30KRCR33）。为了研究这些保守碱性区域附近酸性氨基酸的功能作用，我们将第一个保守碱性区域的E12和第三个保守碱性区域的E29分别突变为赖氨酸（Lys，K）或精氨酸（Arg，R）。

讨论

Calcin是一种从蝎子毒液中提取的碱性肽，具有高亲和力，能够选择性靶向RyRs（Vargas-Jaimes等人，2017年；Haji-Ghassemi等人，2023年）。先前的突变扫描实验表明，将蝎子毒液肽中的酸性氨基酸突变为中性丙氨酸可以增强Calcin的活性。相反，将碱性氨基酸突变为丙氨酸则会降低其活性（Yao等人，2024b）。

结论

通过系统的功能分析，我们确定了四种突变肽的关键结构特征。尽管它们的氨基酸序列存在差异，所有Calcin都沿着ICK基序折叠成紧凑的球状结构。在自然进化过程中，Calcin氨基酸序列的突变赋予了这些肽对RyR受体的不同结合能力。我们的研究特别揭示了位于-COOH末端的三个碱性残基簇（8KRCK11、

CRediT作者贡献声明

连波 王：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，数据管理。小雨 花：撰写 – 审稿与编辑，可视化，验证，概念化。小芬 马：方法学，研究，形式分析，数据管理。建国 王：研究，数据管理。李 小：方法学，研究。石敏 王：研究，数据管理。姜浩 刘：研究，数据管理。杨飞 赵：研究，数据管理。赫克托·H·瓦尔迪维亚：

知情同意声明

已获得所有参与研究者的知情同意。

利益冲突

作者未报告任何潜在的利益冲突。

伦理声明

不适用伦理声明。

资助

本工作得到了2023年国家科技部重点研发计划（中美国际合作项目[项目编号：2023YFE0117800]、海军医科大学校级基础医学研究项目[项目编号：2024QN008]、国家自然科学基金（项目编号：31972751）、山西省基础研究项目（项目编号：202403021211041）以及山西省现代农业产业技术体系建设项目（项目编号：2026CYJSTX13-10）的资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文报告的工作。