综述：POLG相关疾病中的模式生物：从酵母到多细胞系统的见解

《Cell Death & Disease》：Model organisms in POLG-related disorders: insights from yeast to multicellular systems

本综述系统评述了POLG（DNA polymerase gamma）相关线粒体疾病的模式生物研究进展。文章重点阐述了从酵母、线虫、果蝇到斑马鱼和小鼠等模型在揭示疾病机制（如mtDNA不稳定、OXPHOS缺陷）和推动药物重定位（drug repurposing）方面的独特价值，强调了多物种联合筛选策略对于开发靶向治疗（如clofilium tosylate和PZL-A）的重要性，为这类尚无批准疗法的罕见病提供了转化研究新视角。

　　

模型生物在POLG相关疾病研究中的价值

线粒体遗传病是一类复杂的疾病，它们通过损害细胞的能量生产，导致跨越多器官系统的多种临床表现。这些疾病源于线粒体DNA（mtDNA）或核DNA的突变。在核DNA相关的病例中，编码线粒体DNA聚合酶γ（POLγ）亚基的POLG和POLG2基因突变尤为重要，它们会导致诸如Alpers-Huttenlocher综合征和进行性眼外肌麻痹（PEO）等疾病。目前，针对POLG相关线粒体疾病的特异性疗法仍然匮乏，这凸显了开发有效干预措施的迫切性。

线粒体与线粒体DNA

线粒体是真核细胞中至关重要的细胞器，其主要功能是通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生ATP。人类mtDNA是一个16,569碱基对的环状分子，编码37个基因，包括13个对OXPHOS系统至关重要的蛋白质、22个tRNA和2个rRNA。与核DNA不同，mtDNA的复制是持续且独立于细胞分裂的。最小的mtDNA复制体由DNA聚合酶γ（POLγ）全酶（由POLG和POLG2亚基组成）、用于解旋DNA的TWINKLE解旋酶和用于稳定单链DNA的mtSSB蛋白构成。

POLG相关疾病与线粒体DNA维持

POLG相关疾病是mtDNA维持缺陷（MDMDs）中最常见和研究最深入的一类。这些疾病由POLG（染色体15q25）或POLG2（染色体17q24.1）基因的突变引起，这两个基因分别编码POLγ的催化亚基（p140）和辅助亚基（p55）。POLG基因的突变会破坏POLγ的功能，导致mtDNA不稳定，表现为多重缺失的积累、点突变或拷贝数耗竭。目前已有超过300种POLG致病性突变被记录。这些遗传损伤损害了线粒体功能，导致一系列疾病谱，其临床表现取决于突变类型、mtDNA不稳定的程度以及受累的组织。

常见的POLG相关疾病谱包括：儿童期发病的脑肌肝病谱系（MCHS），特征为脑病、发育迟缓、肌病、肌张力低下和肝衰竭；通常在2至4岁之间出现的Alpers-Huttenlocher综合征（AHS），表现为难治性癫痫、精神运动倒退、肝病、共济失调和神经病变；青少年期发病的肌阵挛性癫痫肌病感觉性共济失调（MEMSA），与小脑性共济失调、癫痫、脑病和肌病相关；以及成年期发病的进行性眼外肌麻痹（PEO），分为显性（adPEO）和隐性（arPEO）形式，影响眼外肌，导致上睑下垂和眼肌麻痹。

POLG相关疾病也可由POLG2的突变引起。与POLG突变不同，POLG2变异似乎不影响mtDNA合成的保真度。显性POLG2突变通常导致adPEO，并常伴有骨骼肌无力、共济失调、抑郁和进行性神经感觉问题等额外症状。首个报道的由POLG2突变引起的adPEO病例是一个发生在二聚化域的错义变异c.1352G>A（p.Gly451Glu）。这类突变会导致mtDNA复制叉停滞，随时间推移引起缺失和耗竭。隐性POLG2突变也有报道，例如在一个早发性肝衰竭病例中发现的纯合子c.544C>T p.（Arg182Trp）突变，该突变影响了POLG2的二聚化。

研究POLG相关疾病的模型生物

为了研究POLG相关疾病，科学家们已经开发了多种模型生物，包括酵母、线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠。POLγ的结构和功能在真核生物中有所不同：在酵母和线虫中是单体，在昆虫中是异源二聚体，在脊椎动物中则是异源三聚体，这突显了其在线粒体功能进化中的重要性。

研究人员利用基因敲低（KD）、敲除（KO）、转基因过表达（Tg）、定点诱变、化学或ENU诱变以及人源变异敲入（KI）等多种策略构建了POLG或POLG2的突变模型。

酿酒酵母

酿酒酵母（芽殖酵母）因其与人类线粒体基因的功能保守性，成为研究POLG相关疾病的宝贵模型。值得注意的是，其厌氧代谢特性使其在OXPHOS系统失活的情况下仍能存活。酵母mtDNA主要是线性的，大小在68至86 kb之间，每个核基因组有10-200个拷贝。酵母线粒体基因组由Mip1复制，这是一种单体线粒体DNA聚合酶，与人类POLG有43%的序列同源性。Mip1保留了关键结构域，包括线粒体靶向信号（MTS）、核酸外切酶、连接区和聚合酶区。尽管缺乏辅助亚基，但酵母通过缩短蛋白质亚域序列进行了功能补偿。

酿酒酵母在阐明POLG突变的致病性、其潜在分子缺陷以及遗传背景的影响方面发挥了关键作用。例如，它帮助鉴定了Tyr955Cys和Gly268Ala变异是影响mtDNA复制和突变性的显性突变。该模型通过将人类POLG突变引入Mip1并分析其对酵母生长和存活的影响，已被证明是验证人类POLG突变致病性的优秀工具。

秀丽隐杆线虫

秀丽隐杆线虫是一种自由生活的线虫，由于其生命周期短、易于操作且线粒体功能保守，已成为研究线粒体疾病的优秀模型。与酿酒酵母不同，线虫的mtDNA结构更接近人类，由多个13.7 kb的环状分子组成，具有重叠的基因内容。这些线虫表现出异质性，且mtDNA拷贝数在其生命周期中波动。线粒体基因组的维持对于线虫的发育至关重要，当mtDNA复制被阻断时，其发育会停滞。

线虫在理解线粒体动力学、遗传和线粒体自噬方面至关重要。它通过高效的碱基切除修复机制来补偿核苷酸切除修复和错配修复机制的缺乏，以纠正由活性氧（ROS）积累引起的错误。

polg-1缺陷的线虫，在其单体线粒体DNA聚合酶中携带突变，能正常发育至成年，但表现出mtDNA含量减少、寿命缩短和不育。这是第一个被证明在缺乏活性POLγ的情况下能完成胚胎和幼虫发育的模式生物。在线虫中，mtDNA拷贝数在L3幼虫期之前保持稳定，之后在向成虫过渡期间呈指数级增长。然而，在polg-1突变体中，mtDNA水平降低，导致性腺功能受损。这些发现表明，虽然mtDNA拷贝数的维持对正常发育至关重要，但补偿机制使得polg-1突变线虫即使在没有线粒体复制酶的情况下也能完成胚胎发生和幼虫阶段。

Addo等人建立了一个创新平台，利用线虫来识别负责mtDNA维持的新基因，并发现了与人类MDMDs相关基因的新直系同源物，这是在将靶基因与线粒体疾病联系起来方面的一个突破。

Pitayu等人（2016）分析了一个polg-1（ok1548/+）模型，该模型在聚合酶域携带2149 bp的缺失。杂合突变体表现出产卵量（ brood size）减少，但行为正常。这些发现进一步支持了线虫可以在拥有较少线粒体基因组的情况下存活的观点，尽管更高的拷贝数对于能量需求高的过程（如繁殖）是必需的。

最近，Haroon等人（2018）使用CRISPR-Cas9在线虫中引入了Asp207Ala替换（polg-1（srh1）），模拟了PolgA^D257A突变小鼠。该突变体由于POLγ活性缺陷，同时表现出mtDNA耗竭和突变率升高。

黑腹果蝇

黑腹果蝇为在复杂多细胞生物体中研究聚合酶提供了一个先进的平台。其生命周期短、体型小、繁殖快且易于维护，使其成为理想模型。尽管果蝇和人类的mtDNA基因内容是保守的，但遗传序列存在差异，果蝇mtDNA显示出更高的A-T含量。

与脊椎动物中的异源三聚体POLγ复合物不同，果蝇的线粒体复制酶是异源二聚体。1986年首次纯化的果蝇Polγ复合物揭示了这种异源二聚体结构。此后，Polγ在黑腹果蝇中得到了很好的表征，其在mtDNA复制中的作用仍然是主要的研究焦点。

已产生多种果蝇突变体来研究POLγ功能。催化亚基PolG1（tam突变体）的突变会导致过早死亡、复制体组装改变、mtDNA含量减少和视觉系统缺陷。PolG1缺陷的果蝇也较弱，并表现出发育迟缓。

值得注意的是，黑腹果蝇是第一个用于研究POLγ辅助亚基的动物模型；PolG2缺失突变体表现出严重的表型，包括蛹期致死、mtDNA丢失和细胞增殖受损。

总体而言，果蝇模型在阐明mtDNA维持机制、揭示ROS在调节mtDNA拷贝数中的作用以及推进我们对线粒体疾病的理解方面发挥了重要作用。然而，在将研究结果外推到POLG相关疾病时，必须考虑果蝇与人类之间的机制差异。

斑马鱼

斑马鱼是一种原产于南亚的热带淡水鱼，自20世纪60年代被引入生物学研究以来，已成为研究脊椎动物生物学、发育、遗传学和人类疾病的优秀模式生物。

作为脊椎动物，斑马鱼与人类的亲缘关系比线虫和果蝇等无脊椎动物模型更近，同时在遗传和胚胎操作上比哺乳动物模型更容易。它具有体型小、维护成本低、拥有与人类疾病相关的大部分器官等优势。雌鱼每周可产卵数百枚，其透明的卵使得在整个发育阶段都能轻松监测。这种天然的透明度，结合基于荧光的转基因工具，允许在体内可视化和分析不同组织中的线粒体分布和动力学，使斑马鱼成为研究线粒体病理生理学的宝贵体内模型。

斑马鱼基因组已完全测序并注释良好（GRCz11, 2017），与人类约有70%的蛋白质编码基因共享。

斑马鱼的基因操作技术多种多样，包括反义吗啉寡核苷酸（MO）、锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）、CRISPR-Cas9系统和N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）诱变。

斑马鱼mtDNA与人类mtDNA约有70%的序列同一性，两个基因组都编码37个基因。斑马鱼拥有人类POLG1和POLG2基因的同源物以及异源三聚体POLγ复合物。与小鼠不同，斑马鱼的polg突变体重现了在人类POLG患者中观察到的许多表型。斑马鱼中第一个polg突变体是完全敲除（polg^muz119, polg^muz120），导致显著的mtDNA耗竭、发育延迟、能量代谢受损和胚胎致死。随后，研究了一个成年可存活的ENU诱导的polg无义点突变（polg^sa9574），纯合突变体会发生mtDNA耗竭和其他POLG样表型，包括心脏、骨骼肌、肝脏和性腺缺陷。一个幼虫致死的CRISPR-Cas9产生的微缺失（polg^ia302）也被简要研究过。

第一个斑马鱼polg2敲除系（polg2^ia304）是使用CRISPR-Cas9生成的，在polg2基因的外显子4携带10个核苷酸的缺失。该突变体系表现出与Polg突变体相似的表型，包括严重的mtDNA耗竭、线粒体动力学改变、生长减少、运动活动受损和过早死亡。

这些斑马鱼模型有效地重现了在人类POLG相关疾病患者中观察到的许多临床特征。这些研究强调了POLγ的催化（Polg）和辅助（Polg2）成分在斑马鱼mtDNA复制和生物体存活中的关键作用，因为polg和polg2的纯合突变严重损害幼虫发育和寿命。

小家鼠

小家鼠是一种原产于印度次大陆的啮齿动物，与人类共享约99%的基因，使其成为临床前研究和治疗开发高度相关的模型。大多数近交系实验室小鼠的线粒体基因组来源于M. m. domesticus。小鼠模型在阐明mtDNA维持机制及其与疾病的联系方面发挥了重要作用。

小鼠POLγ与人类全酶非常相似，催化亚基和辅助亚基的相似性高达90%，使其适用于研究人类MDMDs和POLG/POLG2致病性变异。Hance等人（2005）产生的第一个Polg缺失突变体揭示，纯合突变体在E7.5和E8.5之间死亡，证明了POLG在哺乳动物胚胎发育中的重要作用。这些突变体比杂合子和野生型同窝仔更小，并且表现出发育迟缓。Lewis等人（2007）开发了一个在心脏组织中过表达Tyr955Cys POLG突变的转基因小鼠系。这导致寿命缩短、mtDNA耗竭和各种心脏异常。Zhang等人（2000）产生了一个在心脏过表达p.Asp181Ala（Polg^D181A）变异的转基因小鼠，通过心肌病观察到mtDNA突变和