《International Journal of Nanomedicine》：A Rapid Method Based on Colloidal Selenium Nanoparticle to Detect NT-proBNP Antigen in Serum for Monitoring Acute Heart Failure
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本文开发了一种基于聚乙二醇20000（PEG20000）和十二烷基硫酸钠（SDS）修饰的胶体硒纳米颗粒的免疫层析试纸条，用于快速、灵敏地检测血清中的N末端B型利钠肽前体（NT-proBNP）。该方法的检测限（LOD）低至250 pg/mL，符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南（2024）》中排除急性心衰（AHF）的阈值标准（≤300 pg/mL），且具有高特异性、良好的重复性和稳定性，为急性心力衰竭的即时检测（POCT）和家庭筛查提供了极具潜力的新工具。
引言
心力衰竭（HF）是一种以心脏泵血功能受损为特征的临床综合征，全球患病人数约6400万，且随着人口老龄化，其患病率持续攀升。急性心力衰竭（AHF）是65岁以上患者住院的主要原因，其预后极差，住院死亡率高达12%，1年再住院率约45%，1年死亡率约22%。因此，AHF的早期诊断与干预至关重要。
目前，心电图（ECG）和心脏磁共振（CMR）是诊断AHF的金标准，但其成本高昂、操作复杂，难以作为大规模筛查工具。相比之下，免疫层析技术（LFIA）具有操作简便、检测快速、成本低廉等优势，非常适合用于即时检测（POCT）和家庭筛查。
N末端B型利钠肽前体（NT-proBNP）是诊断和鉴别诊断AHF的首选生物标志物，也是评估病情严重程度和预后的重要指标。《中国心力衰竭诊断和治疗指南（2024）》明确指出，当NT-proBNP ≤300 pg/mL时可排除急性心力衰竭，≤125 pg/mL时可排除慢性心力衰竭。
目前，胶体金是免疫层析试纸条最常用的标记材料，但其制备过程需要高温煮沸，且原料氯金酸价格昂贵。相比之下，胶体硒的原料亚硒酸钠成本低廉，且可在室温下通过化学还原法合成，具有显著的成本和工艺优势。然而，NT-proBNP检测限较低，易出现假阳性。为解决这一问题，本研究开发了一种新型的胶体硒合成方法，通过包被聚乙二醇20000（PEG20000）和十二烷基硫酸钠（SDS）来提升胶体硒的稳定性、抗体偶联效率，并有效降低背景干扰，从而构建了一种高灵敏、高特异性的NT-proBNP快速检测方法。
材料与方法
材料与仪器
实验所用牛血清白蛋白（BSA）、PEG20000、海藻糖和磷酸盐缓冲液（PBS）购自源叶生物科技有限公司。亚硒酸钠（Na2SeO3）、抗坏血酸（Vc）和十二烷基硫酸钠（SDS）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。小鼠抗人NT-proBNP单克隆抗体（Clone-1和Clone-2）以及重组人源NT-proBNP抗原购自南京百康生物科技有限公司。山羊抗小鼠IgG购自杭州启泰生物技术有限公司。XYZ三维喷膜仪、自动切条机由上海金标生物科技有限公司提供。吸收垫、硝酸纤维素（NC）膜、塑料背衬和样品垫购自德国SARTORIUS公司。
胶体硒的制备
采用抗坏血酸还原法合成胶体硒。首先，分别配制0.1M SDS、0.32M Vc和0.04M Na2SeO3溶液备用。取17mL超纯水于烧杯中，加入100mg PEG-20000，在室温下以600rpm搅拌10分钟。随后依次加入1mL 0.1M SDS、1mL 0.04M Na2SeO3，各搅拌20分钟。最后加入1mL 0.32M Vc，溶液颜色逐渐由无色变为橙红色，继续搅拌20分钟即得胶体硒溶液。
胶体硒的表征
使用马尔文Zetasizer Nano-ZS90分析仪测定胶体硒的粒径分布和Zeta电位。使用安捷伦8453紫外可见分光光度计扫描其吸收光谱。使用日立HT7700透射电子显微镜（TEM）观察胶体硒及抗体标记胶体硒的形貌。通过X射线光电子能谱（XPS）分析胶体硒的价态。
胶体硒标记NT-proBNP检测抗体的制备
取1mL胶体硒溶液，用0.1M K2CO3溶液调节pH至5.5。加入13μL 0.2 mg/mL的NT-proBNP单克隆抗体（Clone-1）溶液，孵育20分钟。加入100μL 10% BSA封闭，孵育20分钟。4°C、8500 rpm离心15分钟，弃上清，用50μL复溶液（含3% BSA、5%蔗糖、5%海藻糖、0.125% Tween-20、0.1% P300、0.01M Tris-HCl，pH 4.5）重悬沉淀。
免疫层析试纸条的制备
试纸条由吸收垫、样品垫、结合垫、NC膜和塑料背衬组成。结合垫和样品垫分别用缓冲液处理并于40°C烘干2小时。使用XYZ三维喷膜仪，将捕获抗体（NT-proBNP mab-Clone-1，1.5 mg/mL）和羊抗鼠IgG抗体（1.7 mg/mL）分别以0.9 μL/cm和0.8 μL/cm的浓度喷涂在NC膜上，形成检测线（T线）和质控线（C线）。NC膜于40°C真空干燥2小时。将各组件粘贴在塑料背衬上，用切条机切成4mm宽的试纸条。将重悬的胶体硒抗体复合物加到结合垫上，40°C烘干20分钟，组装成成品试纸条。
优化与性能评估
通过控制变量法优化了抗体标记pH、抗体添加量、复溶液pH及Tween-20含量等关键参数。通过检测不同浓度的NT-proBNP标准品，确定其视觉检测限（LOD）。通过检测肌钙蛋白、磷脂酶A2、C反应蛋白（CRP）、BNP和cTnl等干扰物，评估其特异性。通过批内和批间重复性实验、高剂量钩状效应（Hook Effect）实验以及加速稳定性实验，全面评估试纸条的分析性能。
临床样本检测
收集泰兴市人民医院经病理和临床确诊为心力衰竭患者的30份血清样本，经伦理委员会批准（批件号：LS2024031-2）。所有样本用PBS按1:1稀释后，使用本研究制备的胶体硒试纸条进行检测。
结果
胶体硒的表征
合成的胶体硒溶液呈橙红色透明状。紫外可见吸收光谱显示其在300nm处有最大吸收峰。动态光散射（DLS）分析显示其平均粒径为69.6nm，多分散指数（PDI）为0.023，表明粒径分布均一。透射电镜（TEM）观察显示，胶体硒呈球形，且抗体标记后颗粒外围可见明显的蛋白晕。XPS分析显示，Se3d高分辨谱图中存在54.7 eV（Se3d5/2）和55.5 eV（Se3d3/2）两个主峰，表明胶体硒为零价态，且抗体与胶体硒的结合是通过静电吸附等分子间作用力，而非共价键。TEM能谱面扫图证实了N和O元素的存在，进一步证明了抗体成功结合在胶体硒表面。
试纸条工艺与条件优化
通过系统优化，确定了最佳工艺条件：PEG20000与SDS的质量比为1:20；抗体标记的最佳pH为8；最佳抗体添加量为2.5μg；复溶液中Tween-20的最佳浓度为0.125%，最佳pH为8。研究还发现，在合成过程中添加SDS能显著改善假阳性问题，使背景更干净。
试纸条的灵敏度与特异性
灵敏度测试结果显示，该试纸条对NT-proBNP的视觉检测限为0.25 ng/mL（250 pg/mL）。特异性测试结果表明，在检测肌钙蛋白、磷脂酶A2、CRP、BNP和cTnl时，T线均无显色，而NT-proBNP组显色明显，且与上述干扰物共存时，显色不受影响，证明了该试纸条具有优异的选择性。
重复性、钩状效应与稳定性
批内和批间重复性实验结果显示，试纸条具有良好的重复性和一致性。高剂量钩状效应实验表明，当NT-proBNP浓度达到250 ng/mL时，T线颜色强度不再随浓度增加而增强，即钩状效应阈值为250 ng/mL。加速稳定性实验表明，试纸条在4°C储存30天后，性能保持稳定。
临床样本检测
对30份临床血清样本的检测结果显示，该胶体硒试纸条的检测结果与临床诊断结果高度一致，证明了其在临床实际应用中的准确性和可靠性。
讨论
本研究成功开发了一种基于PEG20000和SDS修饰胶体硒的免疫层析试纸条，用于快速检测血清中的NT-proBNP。该方法通过优化胶体硒的合成与标记工艺，实现了250 pg/mL的高灵敏度，完全满足《中国心力衰竭诊断和治疗指南（2024）》中排除急性心力衰竭的阈值要求。SDS的引入有效降低了背景干扰，显著减少了假阳性的发生。特异性实验证实了该方法对NT-proBNP的优异选择性。该技术为急性心力衰竭的即时检测、家庭筛查以及基层医疗机构的初步筛查提供了一种快速、准确、低成本的新方案。
结论
本研究成功构建了一种基于胶体硒纳米颗粒的免疫层析平台，用于血清NT-proBNP的快速检测。该平台具有高灵敏度（250 pg/mL）、高特异性、良好的重复性和稳定性，且胶体硒合成工艺简单、成本低廉。该试纸条的开发填补了心力衰竭即时检测产品的市场空白，在家庭自测和基层医疗机构筛查方面具有广阔的市场前景和竞争优势。
