《GigaScience》：An evaluation of computational methods for reconstruction of human viral DNA genomes
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本研究针对病毒基因组重建工具激增但缺乏统一评估标准的现状，开发了开源基准测试框架HVRS，系统评估了16种重建工具在73个合成和6个真实数据集上的性能。研究通过身份相似度、标准化压缩半距离(NCSD)等指标，揭示了不同工具在测序深度、SNP比例、污染等条件下的表现差异，为病毒基因组学研究提供了重要的工具选择依据。
随着高通量测序技术的飞速发展，病毒基因组研究迎来了前所未有的机遇，但如何从复杂的测序数据中准确重建人类病毒基因组却成为制约研究进展的瓶颈。临床样本中病毒与宿主DNA的复杂混合、病毒本身的高突变率以及测序过程中的各种技术误差，使得病毒基因组重建成为一项极具挑战性的任务。面对市场上不断涌现的各类重建工具，研究人员往往陷入选择困境——究竟哪种工具能在准确性和计算效率之间取得最佳平衡？
在这项发表于《GigaScience》的研究中，Maria J. P. Sousa领衔的国际团队开展了一项系统性评估研究，建立了名为HVRS的开源基准测试平台，对16种主流病毒基因组重建工具进行了全面性能测试。研究人员创新性地设计了包含73个合成数据集和6个真实数据集的测试体系，通过多种评估指标揭示了不同工具在各种条件下的表现特征。
研究团队采用了多层次的评估方法：首先通过系统文献检索确定了16种符合条件的主流重建工具，包括参考自由(RF)、参考依赖(RB)和混合方法(HB)三类。随后构建了包含不同突变率(0-15%)、污染程度、线粒体DNA含量和测序深度(2x-40x)的合成数据集，使用ART和wgsim进行读长模拟。关键的技术方法包括使用GeCo3压缩工具计算标准化压缩半距离(NCSD)和标准化相对压缩(NRC)，通过dnadiff评估基因组身份相似度，利用SeqKit分析支架长度特征，并采用FALCON-meta进行真实数据集的病毒组成分析。所有工具均在统一的计算环境下运行，设置了48GB内存和6个CPU线程的资源上限，每个数据集重复执行三次以确保结果可靠性。
基准测试结果
线粒体DNA和污染的影响
研究发现污染和线粒体DNA的加入显著影响了部分工具的重建能力。当数据集包含1%SNP和2x-40x测序深度时，Haploflow和QuRe无法重建深度覆盖低于5x的数据集。评估结果显示，污染和线粒体DNA的加入导致工具性能平均下降1.1%(身份相似度)、6.7%(NCSD)和6.9%(NRC)。特别值得注意的是，VirGenA对这些添加成分表现出较高敏感性。
SNP比例和测序深度的影响
高SNP比例(超过7%)和低测序深度(2x)对大多数工具构成挑战。在2x深度覆盖下，metaSPAdes和QuRe无法重建任何数据集，而TRACESPipeLite在SNP比例达到13%时仅能重建线粒体DNA。随着测序深度增加到40x，工具性能显著改善，NCSD和NRC指标分别提升66.9%和67.3%，支架平均长度增加178.8%。
读长和病毒组成的影响
读长对工具性能产生明显影响，75bp读长下仅有11种工具能成功重建，而150bp和250bp读长下分别有15种和16种工具可完成重建。不同病毒组成(B19V、HPV、VZV、MCPyV等)的测试表明，大多数工具在不同病毒组合下表现稳定，但ViSpA、QVG和PEHaplo重建的碱基数显著多于其他工具。
错误率的影响
错误率增加对工具性能产生负面影响，但这种影响在高测序深度下有所缓解。值得注意的是，使用不同读长模拟工具(ART与wgsim)得到的数据集在工具表现上存在差异，提示工具可能对特定读长特征有优化。
综合性能评估
在65个合成数据集的整体评估中，coronaSPAdes、IRMA、LAZYPIPE等8种工具能够重建所有数据集。基于压缩的评估指标NCSD和NRC显示，SPAdes、coronaSPAdes、TRACESPipe和metaSPAdes表现最佳(NCSD<0.15)，而QuRe表现最差(NCSD接近1)。计算资源方面，参考自由(RF)方法整体效率最高，而QuRe和VirGenA资源消耗最大。
真实数据集表现
在6个真实数据集测试中，除PEHaplo外所有工具均能重建至少一个数据集。metaSPAdes、coronaSPAdes和SPAdes重建的碱基数最多(平均超过3,000,000bp)，而QVG、TRACESPipe和metaviralSPAdes产生的支架平均长度最长。在没有金标准的情况下，评估主要依赖支架长度和数量等间接指标。
工具关联分析
研究还揭示了不同重建工具之间的内在联系，SPAdes和SAVAGE是最常用的重建工具，而BWA和Bowtie是最主流的比对工具。这种工具间的依赖关系影响了整个分析流程的效率和可靠性。
研究结论表明，不存在适用于所有场景的最佳重建工具，工具选择需根据具体需求权衡。对于低深度覆盖和低SNP比例的数据，TRACESPipe和QVG表现优异；而高SNP比例情况下，metaSPAdes更具优势。在高深度覆盖(≥5x)场景下，SPAdes、coronaSPAdes、LAZYPIPE和TRACESPipe是可靠选择。若关注计算效率，coronaSPAdes和LAZYPIPE具有明显优势；而在资源受限环境下，Haploflow、SSAKE和V-pipe更为适合。
该研究建立的HVRS基准测试平台为病毒基因组研究领域提供了重要的方法论支持，其开源特性允许研究者根据特定需求进行定制化测试。研究不仅系统评估了现有工具的性能特征，还揭示了不同算法在不同条件下的适用边界，为工具选择和改进提供了实证依据。随着测序技术的不断发展和病毒基因组学研究的深入，这种标准化评估框架将有助于推动计算方法的优化和创新，最终促进病毒相关疾病的研究和防治工作。
