《Biomaterials Advances》：3D printing of Y-27632 enhanced elastic hydrogel conduits for peripheral nerve repair
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采用连续3D打印技术制备GelMA/SF-MA水凝胶导管负载Y-27632纳米颗粒，通过抑制ROCK-LIMK-ADF/cofilin通路促进轴突再生，在12mm sciatic神经缺损模型中显著提升神经修复效率及功能恢复。
吴文彬|刘浩帆|张佳梅|董银初|彭敏|朱琪|张毅|赵伟|张莉|冉雅|刘金禄|李博雅|李文涛|胡宇|段静竹|马玲沟
中国成都，成都大学基础医学科学学院
摘要
神经导引导管为周围神经修复提供了先进的工具，但由于轴突再生效果不佳，其疗效仍有限。Y-27632是一种ROCK抑制剂，具有促进轴突再生和功能恢复的潜力。在本研究中，我们展示了一种含有Y-27632的弹性水凝胶导管，用于有效的神经修复。该导管由明胶甲基丙烯酰（GelMA）/丝素蛋白甲基丙烯酰（SF-MA）水凝胶制成，并负载了Y-27632与聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）/聚乙烯醇（PVA）纳米颗粒的复合物，通过连续3D打印工艺快速制备而成。Y-27632可以从导管中持续释放，以促进轴突生长。同时，这种生物活性明胶/丝素蛋白水凝胶有助于施万细胞的黏附、增殖和迁移。此外，弹性水凝胶导管可以通过手术缝合到神经断端，以桥接神经缺损。在术后16周时，这种导管能有效促进轴突再生和髓鞘重建，促进肌肉再神经支配，并在12毫米的神经缺损模型中改善功能恢复。这些发现表明，含有Y-27632释放的弹性水凝胶导管可能为长段周围神经缺损提供一种有前景的治疗策略。
引言
周围神经损伤（PNI）是一种常见的疾病，由创伤、手术并发症、肿瘤和其他疾病引起[1]。PNI常导致感觉和/或运动功能障碍，甚至残疾或瘫痪，严重影响患者的生活质量[2,3]。尽管周围神经在损伤后可以自发再生[4]，但在没有其他干预的情况下，再生速度相对较慢，导致功能恢复不佳，尤其是在长段缺损的情况下。自体移植是目前PNI手术修复的金标准，但其应用受到供体来源有限、供体部位并发症和二次创伤的限制[5]。因此，神经导引导管作为一种替代方案出现，用于桥接较大的神经缺损，因为它们可以防止疤痕形成并为神经再生提供物理支持[2]。然而，传统导管的治疗效果仍需显著改进，因为轴突再生不佳总是导致感觉和运动功能恢复不完全。先前的研究表明，再生微环境对轴突延长和重新连接至关重要[6,7]。因此，需要开发新的神经导引导管来建立促进轴突再生和功能恢复的再生微环境。
能够为轴突再生提供导向信号的生物活性分子可以调节与神经修复相关的微环境。神经损伤后，轴突的生长和延长对于受伤神经的重新连接和功能恢复至关重要[8,9]。一项先前的研究发现，通过增加肌动蛋白周转率可以促进轴突再生，而肌动蛋白解聚因子（ADF）/协同蛋白可以通过切断F-肌动蛋白来调节肌动蛋白周转率[10]，为促进轴突再生提供了新的靶点。ROCK-LIMK通路直接调控协同蛋白的磷酸化水平。LIM激酶（LIMK）作为Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）的下游效应器，可以调节协同蛋白的肌动蛋白切断活性。ROCK-LIMK抑制可解除协同蛋白的磷酸化，使其恢复活性形式，从而增强协同蛋白的切断活性和肌动蛋白周转率[11]。因此，ROCK-LIMK-协同蛋白对通过控制肌动蛋白周转率来调节轴突生长至关重要。Y-27632是一种ROCK的ATP竞争性抑制剂[12,13]，有可能通过这一途径促进轴突延长。因此，结合Y-27632是一种改善神经修复的有前景的策略。
近年来，基于数字光处理（DLP）的3D打印技术已被广泛用于制造神经导引导管[14],[15],[16],[17],[18]。这项技术能够精确制造出与神经缺损几何形状相匹配的个性化导管[19]，因为它在制造具有复杂结构的定制支架方面具有显著优势。此外，药物可以在温和条件下与预聚物灵活结合，创建能够在损伤部位局部释放药物的导管[20,21]，从而建立有利于轴突再生的再生微环境。然而，目前仍缺乏具有最佳物理和生物特性的预聚物，适用于DLP基于3D打印的神经修复应用。明胶甲基丙烯酰（GelMA）是DLP生物打印中最常用的预聚物之一，由于其含有高比例的细胞黏附肽而具有良好的生物相容性[22]，但其机械性能较差，难以与天然神经匹配和缝合[23]。最近，开发了机械性能更优的丝素蛋白甲基丙烯酰（SF-MA）[24]，成为生物打印神经导管的 promising 材料。然而，它缺乏细胞黏附基序，可能不利于神经再生。结合GelMA和SF-MA可能有助于开发同时具有良好生物活性和机械性能的复合水凝胶，以支持轴突再生。
在这项研究中，我们开发了一种负载Y-27632纳米颗粒的3D打印GelMA/SF-MA水凝胶导管，以建立促进轴突再生和功能恢复的再生微环境（图1）。该3D打印导管被缝合到受伤的神经上，以桥接12毫米的坐骨神经缺损，并通过功能、电生理、形态和组织学评估来评估其治疗效果。负载Y-27632的导管能够促进神经重新连接和功能恢复，显示出在长段PNI临床治疗中的潜力。
材料
Y-27632从MedChemExpress购买。根据先前的报道[25]制备了苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂（LAP）。施万细胞和大鼠pheoehromoeytoma细胞（PC12）从BeNa Culture Collection（中国）购买，而Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性，200–220克）从成都Dossy Experimental Animals Co., Ltd.购买。施万细胞和PC12细胞的培养基为含有胎牛血清（10%）的Dulbecco改良Eagle培养基
Y-27632对轴突生长的影响
已有研究表明，活性协同蛋白可以通过增加肌动蛋白周转率来促进轴突再生[10]。Y-27632（图2a）是一种ROCK抑制剂，可能通过阻断下游LIMK激酶的活性来解除协同蛋白的磷酸化并激活它（图2b）。因此，Y-27632被认为是一种潜在的促进损伤后轴突再生的药物。在本研究中，我们探讨了Y-27632对轴突生长的影响。首先，通过CCK-8检测评估了Y-27632的细胞毒性。
讨论
目前，长段周围神经缺损的功能恢复仍然是临床医学中的一个挑战[56,57]。仍需要构建一个再生微环境来调节与神经修复相关的过程[58,59]。损伤后，受影响部位会经历一个复杂的再生过程，包括炎症反应、脱髓鞘、轴突再生和髓鞘重建[8,60,61]。在神经再生过程中，轴突再生
结论
在这项研究中，我们使用基于DLP的3D打印技术开发了一种含有Y-27632纳米颗粒的弹性水凝胶导管。这种导管不仅可以持续释放Y-27632以促进轴突再生，还可以通过生物活性弹性水凝胶促进施万细胞的黏附、增殖和迁移。负载Y-27632的导管被证明可以增强电生理功能，促进肌肉再神经支配，并促进轴突再生和髓鞘重建
作者贡献声明
吴文彬：撰写——原始草稿、研究、数据分析。刘浩帆：撰写——审阅与编辑、方法学、数据分析。张佳梅：撰写——审阅与编辑、研究。董银初：研究、数据分析。彭敏：方法学。朱琪：方法学。张毅：研究。赵伟：研究。张莉：方法学。冉雅：研究。刘金禄：撰写——审阅与编辑。李博雅：撰写——审阅与编辑。李文涛：方法学。胡宇：方法学。
伦理批准
所有动物实验研究均遵循四川大学动物研究与伦理委员会的指导方针和规定（批准编号2020367A）进行。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（32271468）、四川大学西华医院1·3·5卓越学科项目（ZYYC23005）和四川大学西华医院博士后研究项目（2023HXBH081）的资助。作者感谢四川大学分析检测中心的郑淑萍在SEM检测方面的帮助。作者还感谢国家工程研究中心的熊世斌博士
