《Bioorganic Chemistry》：Naphthalimide-nitrosourea derivatives as dual-function antitumor agents for exploration of their action mechanisms and chemical degradation process
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抗肿瘤药物研究：合成新型naphthalimide–nitrosourea衍生物（A-1–A-3），其通过DNA插入、拓扑异构酶II抑制及ROS生成协同作用显著抑制HepG2和HeLa细胞增殖（IC50值优于mitonafide），电化学证实其降解产物增强DNA烷基化效应。
韩振宇|贾子涵|孟凡翔|于日雷|王琴|夏亚木|高伟伟
中国青岛市科技大学化学工程学院生物大分子药物发现与开发重点实验室，青岛市266042
摘要 在本研究中，合成了一系列新型萘酰亚胺-亚硝脲衍生物（A-1 –A-3 ），作为潜在的抗肿瘤剂。体外抗增殖活性测定表明，A-1 –A-3 对HepG2（15.98–24.32 μg/mL）和HeLa（8.54–19.03 μg/mL）细胞系的抑制作用显著增强，明显优于参考药物米托纳菲德。机制研究表明，这些衍生物通过DNA插层、拓扑异构酶II抑制以及ROS生成增加来发挥其作用。电化学研究显示，在中性或碱性条件下，A-1 –A-3 会降解为羟乙基取代的萘酰亚胺。同时，亚硝脲基团会产生具有DNA烷基化和交联能力的活性碳正离子。这种双重机制——萘酰亚胺环的DNA插层和亚硝脲基团的烷基化——产生了强烈的协同抗肿瘤效果。此外，还证实了DNA氧化损伤途径，显示出在高血清样本中的高抗干扰能力和实际应用性。总体而言，这些发现突显了A-1 –A-3 作为具有独特结构和机制优势的多功能抗肿瘤候选物的潜力。
引言 癌症是患者死亡的主要原因之一[1]。关键调控基因（如原癌基因、肿瘤抑制基因和DNA修复基因）的突变通常与癌症的发生有关[2,3]。癌症的标志性特征包括不受控制的增殖、血管生成、转移和侵袭性。尽管有多种治疗策略，但针对DNA的药物仍然非常有效[4]。经典的例子包括DNA插层剂和烷化剂，它们通过干扰复制和转录来抑制肿瘤细胞生长。
作为遗传信息的载体，DNA是主要的药物靶点之一[5]。DNA插层剂插入DNA的双螺旋结构中，与相邻的碱基对相互作用并破坏DNA结构，最终导致细胞死亡[6]。如今许多抗癌药物属于平面发色团DNA插层剂类[7]，例如蒽环类药物多柔比星和阿克拉比星。此外，基于萘酰亚胺的抗肿瘤分子因其强大的DNA插层能力而多年来被广泛研究[8]，并已进入临床试验（例如米托纳菲德和阿莫纳菲德）[9]（图1）。然而，它们对某些实体瘤（如结直肠癌[10]、胃癌[11]、宫颈癌[11]和中枢神经系统癌症[12]）的效果仍然有限。
近年来，研究人员对通过取代1,8-萘酰亚胺环的不同位置来合成萘酰亚胺衍生物并探索其抗癌潜力表现出浓厚的兴趣[13]。据报道，萘并二亚胺-萘酰亚胺复合物可以通过选择性靶向多聚G-四链结构来促进端粒损伤[14]。在另一个案例中，4-(N-二硫苯基哌嗪)-1,8-萘酰亚胺被发现是一种高效的多靶点抗肿瘤剂，具有良好的疗效、有限的毒性和低耐药性[15]。在这些修饰中，在萘酰亚胺环的N 位置引入柔性链可以显著增强抗肿瘤活性[16]，而在4位置进行烷基或氨基修饰也能赋予衍生物强大的抗癌效果[17]。这些衍生物表现出多样的抗肿瘤特性，涵盖了更广泛的肿瘤细胞系。因此，基于萘酰亚胺环设计具有跨多种细胞系广谱治疗效果的新抗肿瘤分子仍然是一个重要的研究方向。
烷化剂是另一类主要的DNA靶向药物，临床应用历史超过60年[18]。这些药物直接作用于DNA，诱导交联、链断裂和异常碱基配对，从而抑制细胞分裂[19]。氯乙基亚硝脲（CENUs）是一类重要的烷化剂，广泛应用于各种癌症的临床治疗[20]，包括脑肿瘤、淋巴瘤、胶质瘤和其他恶性肿瘤[21]。它们的抗癌活性被认为与DNA链间交联的形成密切相关[22]。CENUs会自发分解形成氯乙基化中间体，攻击鸟嘌呤的O6位点，产生O6-氯乙基鸟嘌呤，导致dG-dC交联[23,24]。这些交联在DNA复制和转录过程中抑制链分离，触发癌细胞凋亡。
考虑到DNA插层剂和烷化剂的互补机制，我们设计了一系列新型萘酰亚胺-亚硝脲衍生物作为双功能抗肿瘤分子。为了合理设计药物分子，采用了分子对接技术来预测与DNA和蛋白质的相互作用，指导有潜力候选物的选择。基于对接结果，随后合成了具有强结合潜力的萘酰亚胺-亚硝脲衍生物并进行了结构表征（图1）。评估了候选分子对肿瘤细胞的抗增殖活性。通过光谱[25,26]和电泳分析[27]验证了DNA结合。分子动力学（MD）模拟可以追踪系统在不同时间尺度上的运动轨迹和状态变化，从而揭示结合稳定性[28]。电化学技术进一步提供了关于候选分子潜在代谢途径的见解[29,30]。最后，构建了多种类型的电化学传感器[31],[32],[33]来研究候选分子引起的DNA损伤机制。因此，本研究介绍了一类新型的双功能抗肿瘤分子，有望克服现有基于萘酰亚胺的疗法的局限性。
部分内容 分子对接 使用分子操作环境（MOE）进行分子对接研究，初步评估药物候选物的DNA结合潜力。DNA序列（PDB:
2KY7 ）和DNA-topo II复合物（PDB:
3QX3 ）来自蛋白质数据库。根据对接结果，选择与DNA和DNA-topo II复合物结合亲和力最强的药物分子进行进一步分析。
目标分子筛选 药物设计和虚拟筛选技术可以高效筛选现有化合物并设计新型药物分子，显著减少研究所需时间[35]。其中，分子对接模拟能够有效预测药物分子与DNA之间的相互作用模式[36]。通过使用分子对接来模拟和预测底物与配体之间的结合模式和亲和力，可以识别出最佳底物。十六种萘酰亚胺-亚硝脲结论 总结来说，我们设计了一系列萘酰亚胺-亚硝脲衍生物，并确定A-1–A-3 为前三名候选物。这些目标化合物通过取代、酯化和硝化反应方便地获得，其结构通过NMR和HRMS得到确认。A-1–A-3 对HepG2和HeLa细胞的抗增殖活性比米托纳菲德更强，但具有非选择性细胞毒性。机制研究表明，A-1–A-3 通过
CRediT作者贡献声明 韩振宇： 撰写——初稿，研究，数据分析。贾子涵： 撰写——初稿，研究，数据分析。孟凡翔： 数据分析。于日雷： 软件支持。王琴： 项目管理。夏亚木： 监督，项目管理，资金筹集。高伟伟： 撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，项目管理，研究，资金筹集，数据分析。
利益冲突声明 作者声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢 本工作部分得到了国家自然科学基金 （编号：21472105）、山东省自然科学基金 （编号：ZR2020QB168）、澄光高性能氟材料创新中心 （编号：SCFY2402）和山东省高等学校青年创新团队项目 （编号：2022KJ309）的支持。
