人参皂苷AD-1通过调节HIF-1α/HSP/TGF-β1信号通路及间充质转化来改善肺纤维化的机制

《Bioorganic Chemistry》：Mechanism of ginsenoside AD-1 improving pulmonary fibrosis by regulating the HIF-1α/ HSP/TGF-β1 signaling pathway and mesenchymal transition

人参酸性水解物AD-1通过抑制TGF-β1/EMT和HIF-1α信号通路改善肺纤维化

　　

作者：季明欣、张玉东、肖先一、马云杰、孙秀娟、王一鹏、马一腾、赵玉清、苏光月

中国沈阳药科大学

摘要

在中国，大约有45万例尘肺病病例，占所有职业病的90%，其逐年增长对全球健康和经济造成了威胁。先前的研究表明，从人参中提取的酸性水解物AD-1对博莱霉素引起的肺纤维化（PF）具有拮抗作用。体外实验表明，AD-1在TGF-β1诱导的A549细胞肺纤维化模型中抑制了上皮-间充质转化（EMT）和缺氧诱导因子（HIF）信号通路。体内实验通过CT成像、肺功能评估以及H&E和Masson三色染色发现，AD-1对二氧化硅（SiO₂）引起的尘肺病具有治疗效果。此外，AD-1通过抑制EMT和HIF-1α的表达，延缓了这些小鼠中SiO₂诱导的肺纤维化的进展。综合这些体外和体内研究结果，可以推测AD-1的抗肺纤维化机制可能与调节HIF-1信号通路和抑制EMT有关。

引言

尘肺病是全球最严重的职业病之一，在发展中国家尤为普遍[1]，一直是公共卫生的重要问题。尘肺病是一种间质性肺病（ILD），由长期吸入无机颗粒物（如硅尘、石棉纤维、煤矿粉尘和混合硅酸盐粉尘）引起[2]。其特征是肺组织弥漫性纤维化，伴有全身炎症和尘肺结节形成[3]，且病情具有进行性和不可逆性[4]。它是常见的继发性肺纤维化疾病。临床表现包括胸闷、胸痛、呼吸困难、咳嗽、咯血、痰液积聚，以及可能的并发症如呼吸道感染、气胸和结核病[5]。未经及时治疗的尘肺病患者平均预期寿命仅为3-5年[6]。据估计，全球仍有数百万工人暴露于硅尘中，这构成了一个重大的公共卫生问题，尤其是在发展中国家[7]。中国的快速城市化和工业化导致大量工人接触粉尘，从而加剧了该国尘肺病的发病率。1995年之前，中国约有600万名煤矿工人，这一数字已降至约290万[8]。尽管如此，这些工人中尘肺病的高发病率和患病率仍令人担忧。2020年的全国职业危害调查（NOHS）显示，采矿、制造业、电力、燃气和水行业约69.3%的企业存在粉尘危害[8]，约47.4%的劳动者面临与粉尘相关的风险[8]。鉴于尘肺病的潜伏期通常为10至20年或更长，未来几年新病例数预计将显著增加。遗憾的是，目前缺乏有效的药物干预和技术来阻止尘肺病的进展，而尘肺病常与其他疾病（如肺结核（PTB）、慢性阻塞性肺病（COPD）、肺动脉高压（PAH）、肺癌等）同时发生[8]。这些并发症进一步降低了患者的生活质量[8]。目前，吡非尼酮（pirfenidone）和尼达尼布（nidanib）是临床常用的抗纤维化药物，但它们会对患者的胃肠道、皮肤和肝功能产生显著不良反应[9]。鉴于缺乏针对尘肺病的治疗药物，亟需具有高效、低毒性和明确作用机制的新药。

人参是一种在中国有悠久药用和食用历史的植物，具有独特的滋补作用和重要的应用价值[10,11]，因此引发了全球范围内的广泛研究。人参水提取物的主要成分包括碳水化合物和蛋白质。根据分配系数，人参皂苷（尤其是Rb1、Rb2、Rb3和Rf）的比例远高于其他成分[12]。人参皂苷作为从人参中提取的活性化合物，通过多种机制发挥多种药理作用。人参皂苷Rg3通过抑制上皮-间充质转化（EMT）和阻断HIF-1α的核定位来缓解肺纤维化[13]；Rb1则通过抑制NLRP3炎性小体和NF-κB通路来减轻博莱霉素（BLM）引起的肺炎症和纤维化[14]。人参皂苷与BLM联合使用可显著改善肺部组织学和形态学表现，并降低NF-κB的免疫表达[15]。人参皂苷对BLM诱导的肺纤维化的保护作用与其调节TGF-β1/Smad信号通路和MMP系统有关[16]。Rg1在大鼠中通过下调TGF-β1和上调Cav-1来保护肺免受BLM损伤[17]；此外，Rg1在体内和体外实验中均能抑制香烟烟雾引起的呼吸道纤维化[18]。Rb1、Rg3、Rh2和CK等人参皂苷常用于治疗呼吸系统疾病，同时Rh1、Rk1、Rg5、Rd和Re也有类似效果[19]。这些皂苷主要通过调节NF-κB、TGF-β/Smad、PI3K/AKT/mTOR和JNK通路来减少肺炎和纤维化，抑制肿瘤进展，从而改善呼吸健康[19]。人参皂苷作为糖皮质激素受体的功能配体，可抑制激酶磷酸化（包括MAPK和ERK1/2），以及NF-κB转录因子的诱导/转位和DNA结合，并抑制促炎介质（如TNF-α、IL-6、IL-8、ROS和MMP-9）[20]。人参通过增加抗氧化酶和减少氧化剂生成来预防氧化应激[20]。总之，人参皂苷主要通过抗炎和抗氧化机制发挥广泛的作用，显示出治疗多种呼吸系统疾病的潜力。

从人参总皂苷酸水解物中分离出的达玛烷型人参皂苷25-ethoxy-dammarane-3β,12β,20-triol（25-OCH₃-PPD，简称AD-1）纯度超过99.0%。与其他人参皂苷相比，这种新发现的人参皂苷具有分子量小和生物利用度高的优势。先前的研究表明，AD-1对小鼠的博莱霉素诱导肺纤维化具有拮抗作用，提示其作为治疗肺纤维化的潜力[21-25]。为进一步阐明AD-1在改善尘肺病中的作用机制，本研究对其进行了深入研究，通过体外和体内模型评估了其保护效果，并探讨了其作用机制。

材料与试剂

转化生长因子β1（TGF-β1）购自PeproTech（目录号100-21C）；噻唑蓝购自大连美伦生物科技有限公司（目录号MB4698）；人α-SMA抗体购自Cell Signaling Technology（目录号56856）；HIF-1α抗体（目录号WL01607）、HSP 90（目录号WL01763）、HSP 70（目录号WL01019）、N-钙粘蛋白（目录号WL01047）和E-钙粘蛋白抗体（目录号WL01482）均来自商业渠道。

AD-1抑制A549细胞中的TGF-β1诱导的增殖和EMT：潜在的治疗意义

本研究探讨了AD-1对TGF-β1（5 ng/mL）诱导的A549细胞肺泡EMT和增殖的影响。在该浓度下，AD-1显著抑制了A549细胞的增殖，其IC₅₀值为19.76 ± 0.87 μM（图1.A）；当直接评估其作用时，IC₅₀值为34.96 ± 2.74 μM（图1.B）。结果表明，5 ng/mL的TGF-β1可促进A549细胞增殖，而AD-1能有效抑制这一过程。

讨论

本研究选择A549细胞作为体外评估AD-1抗肺纤维化活性的对象。A549细胞是非小细胞肺癌细胞，但仍保持正常的上皮细胞表型，因此被用于建立体外肺纤维化模型。TGF-β1在肺纤维化中起关键作用，TGF-β1/Smad和Wnt/β-Catenin通路是诱导细胞EMT的主要机制[26]。

结论

本研究表明，AD-1能够在体外逆转A549细胞的EMT形态变化（图8），同时下调HIF-1α蛋白的表达水平，恢复E-钙粘蛋白的表达并上调N-钙粘蛋白的表达，表明AD-1能够抑制TGF-β1诱导的A549细胞上皮-间充质转化，这与钙调神经磷酸酶-适配蛋白复合物（calcinurin-adaptor protein complex）和HIF-1α信号通路相关。

作者贡献

季明欣和张玉东负责实验和数据收集；季明欣参与检测和分析工作；肖先一、马云杰、孙秀娟、王一鹏和马一腾协助动物护理；赵玉清和苏光月监督实验和手稿撰写。所有作者均审阅并批准了最终稿件。

CRediT作者贡献声明

季明欣：撰写、审稿与编辑、可视化、验证、监督、软件使用、项目管理、方法学设计、实验实施、数据分析、概念化。张玉东：撰写、可视化、验证、监督、方法学设计、实验实施、概念化。肖先一：可视化、监督。马云杰：可视化、监督。孙秀娟：撰写、审稿与编辑、可视化、监督。

资助

本研究得到了[中国国家自然科学基金]（项目编号81703386）、[辽宁省科技厅民生计划项目]（项目编号2021JH2/10300074）、[辽宁省教育厅]（项目编号LJKMZ20221367）以及[沈阳药科大学青年教师职业发展支持计划]（项目编号ZQN2018003）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。