《Computers in Biology and Medicine》：Identification of CRC-specific circRNA biomarkers via a systems biology framework with RT-qPCR validation
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本研究通过整合系统生物学方法，结合TCGA数据集的共表达网络构建和突变谱分析，筛选出关键circRNA（如hsa_circ_0001136、hsa_circ_0005600和hsa_circ_0003832）及蛋白编码基因（PSMC1、HSP70），并通过qRT-PCR实验验证。结果表明这些分子可作为结直肠癌早期诊断和预后评估的潜在生物标志物，为精准肿瘤学策略提供新依据。
朱莉娅·埃扎蒂（Julia Ezzati）|梅赫拉达德·哈希米（Mehrdad Hashemi）|穆罕默德·马赫迪·福尔加尼法尔德（Mohammad Mahdi Forghanifard）|法特梅·拉赫巴里扎德（Fatemeh Rahbarizadeh）|塞皮德·哈莱吉（Sepideh Khaleghi）
伊朗达姆甘伊斯兰自由大学（Islamic Azad University, Damghan）生物系
摘要
结直肠癌（CRC）仍然是一个严重的全球健康挑战，其发病率在伊朗等地区呈令人担忧的增长趋势。尽管在癌症研究方面取得了显著进展，但缺乏可靠的分子生物标志物仍然限制了早期检测和有效的治疗干预。在这项研究中，我们采用了一种综合系统生物学方法来识别和优先考虑对CRC发病机制起关键作用的环状RNA（circRNAs）和蛋白质编码基因。生物信息学分析（包括使用TCGA数据集构建共表达网络和突变分析）通过定量实时PCR（qRT-PCR）进行了实验验证。我们的发现揭示了关键circRNAs之间的不同失调模式：hsa_circ_0001136和hsa_circ_0005600在肿瘤组织中显著上调，而hsa_circ_0003832则表现出明显的下调，这与其抑制肿瘤的作用一致。在蛋白质编码基因亚集中，PSMC1和HSP70的表达谱发生了变化，并通过突变负担和生存相关分析进行了进一步研究。总体而言，这些分子特征显示出在CRC早期诊断和患者分层方面的巨大潜力。将计算预测与实验证据相结合为推进结直肠癌的精准肿瘤学策略提供了坚实的基础。
引言
结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，是癌症相关死亡的第三大原因。无论是在发达国家还是发展中国家，其发病率都在持续上升，给医疗系统带来了巨大的临床和经济负担[1]。仅2023年，美国就报告了超过106,000例新的CRC病例，其中年轻成年人的发病率尤为惊人[2]。同样，在伊朗，预计到2025年CRC的发病率将增加约54.1%，与其他恶性肿瘤（如乳腺癌和甲状腺癌）的上升趋势一致[3]。这些统计数据强调了迫切需要创新的诊断和治疗策略来改善早期检测和患者预后。
尽管在分子肿瘤学领域取得了重大进展，但现有的CRC诊断和治疗方法仍然不足。该疾病是由遗传和表观遗传改变的复杂相互作用驱动的，这些改变促进了细胞的无控制增殖、基因组不稳定性和对凋亡的抵抗[4]。在新兴的调节分子类别中，环状RNA（circRNAs）因其显著的稳定性和组织特异性而成为癌症诊断和预后的潜在生物标志物[5,6]。然而，它们在CRC中的临床潜力尚未得到充分探索，系统性的多层次验证（结合计算预测和实验验证）仍然缺乏。这一限制导致了诊断延迟，并限制了基于circRNA的分子检测在临床实践中的应用。
CircRNAs具有共价闭合环结构，使其能够抵抗外切核酸酶的降解，从而在生物流体中保持稳定性[5,6]。它们在组织和细胞中的特异性表达模式使它们成为精准肿瘤学和液体活检检测的理想候选者[7]。然而，大多数与CRC相关的circRNA研究仍然局限于描述性研究，实验验证或系统级分析有限。解决这一差距对于发现可重复且具有临床相关性的circRNA生物标志物至关重要，这些标志物可以改善CRC的早期诊断和个性化治疗策略。
多项研究已经证明了circRNAs在CRC发病机制中的调节潜力。Xu等人[8]确定circRNA_0000392是一个致癌驱动因子，而Xie等人[9]强调了hsa_circ_0081069通过调节miR-665/E2F3轴的预后相关性。同样，Tian等人[5]和Zeng等人[10]报告说circ_0004585和circHIPK3促进了肿瘤进展和转移。然而，大多数这些发现尚未通过RT-qPCR或RNase R抗性确认等实验验证得到支持，也没有与多组学或系统生物学方法相结合。
为了克服这些限制，本研究采用了一个综合的系统生物学框架，并结合RT-qPCR验证来识别和验证具有潜在诊断和预后价值的CRC特异性circRNAs。我们进一步探讨了它们与核心调节基因（例如PSMC1和HSP70）的功能相关性，以提高生物可解释性和转化应用性。我们的综合方法旨在通过结合生物信息学预测、突变分析和实验确认来填补方法学上的关键空白，从而推动CRC中circRNA生物标志物的发现。
除了circRNA分析外，我们的研究还重点关注了两个核心调节基因PSMC1和HSP70，它们在WGCNA共表达网络中始终处于中心位置。这些基因的选择并非随意；相反，它们在与肿瘤状态最相关的模块中表现出最高的连通性，并且在CRC组织中显著上调，与相邻的正常样本相比。重要的是，这两个基因之前已被证明与驱动CRC肿瘤进展的蛋白酶体和应激反应通路有关。这一综合理由指导了它们在当前研究中的实验验证。
此外，其他非编码RNA（如lncRNAs和miRNAs）也被证明在CRC进展中起着关键的调节作用。例如，NNT-AS1通过MAPK/Erk信号通路和上皮-间质转化（EMT）促进肿瘤生长和转移[12],[13],[14]。同样，关于蛋白酶体相关基因（如PSMC1和PSMC5）的研究强调了CRC复杂的分子景观，并表明circRNAs与其他非编码RNA通路之间可能存在相互作用[6,15]。将这些多组学见解与实验circRNA验证相结合，可能会增强稳健生物标志物的发现，并提供对CRC分子发病机制的更全面理解[16,17]。
数据检索和预处理
我们从exoRBase数据库中检索了包含编码mRNAs和非编码RNA（ncRNAs）的基因表达数据集，使用访问编号
GSE100063和
GSE100206。该数据集共包含44个样本，包括32个正常组织样本和12个结直肠癌（CRC）组织样本。应用了预处理步骤以提高分析精度和可靠性，包括表达值标准化、去除低丰度基因以及log
2(x+1)转换。
数据获取、预处理和基因选择
为了研究结直肠癌（CRC）中的转录组变化，我们从exoRBase数据库（GSE100063和GSE100206）中检索了mRNA和非编码RNA（ncRNA）的表达谱，共包含44个样本（12个CRC样本和32个正常样本）。层次聚类显示肿瘤组织和正常组织之间有明显的分离（图2A），相应的特征热图确认了样本分类的一致性（图2B）。
在18,334个基因的完整数据集中，选择了表达量较低的基因
讨论
结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，在伊朗的发病率尤其高[30]。早期检测仍然是一个主要挑战，因为只有少数患者在疾病初期被诊断出来，而大多数患者在疾病晚期才被发现[31]。这突显了当前诊断方法的局限性，并强调了迫切需要更可靠和精确的生物标志物来进行早期检测。
结论
本研究强调了某些circRNAs（特别是hsa_circ_0001136和hsa_circ_0003832）以及与蛋白质稳态相关的基因（如PSMC1和HSP70）在CRC中的诊断和预后潜力。通过整合系统生物学方法，特别是共表达网络建模，我们识别并优先考虑了在CRC发病机制中起核心作用的枢纽基因。值得注意的是，PSMC1既表现为差异表达基因，也表现为反复突变的基因，这表明它参与了
CRediT作者贡献声明
朱莉娅·埃扎蒂（Julia Ezzati）：研究工作。梅赫拉达德·哈希米（Mehrdad Hashemi）：撰写原始草案、监督、方法学设计、研究实施和概念构思。穆罕默德·马赫迪·福尔加尼法尔德（Mohammad Mahdi Forghanifard）：软件开发和方法学设计。法特梅·拉赫巴里扎德（Fatemeh Rahbarizadeh）：验证工作。塞皮德·哈莱吉（Sepideh Khaleghi）：验证工作和正式数据分析。
数据和材料的可用性
本研究使用和分析的数据可应要求从相应作者处获取。伦理批准和参与同意
所有涉及人类组织和CRC细胞系SW742的程序均遵循《赫尔辛基宣言》的伦理标准和机构规定。在收集组织之前，已从所有患者处获得了书面知情同意。配对肿瘤组织和相邻非肿瘤组织以及SW742细胞的使用是在机构监督下进行的，不需要额外的伦理委员会批准。
资金
本研究未获得公共部门、商业部门或非营利部门的任何特定资助。利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。致谢
作者衷心感谢Farhikhtegan医院提供临床样本和设施的支持。同时，我们也感谢Mazaher Maghsoudlou博士和Mirzaei Nassab博士在本研究过程中提供的宝贵科学支持和建设性讨论。
