基于氟化酶末端酶促18F标记的A2A腺苷受体激动剂开发及其PET成像应用

《European Journal of Organic Chemistry》：A 2A Adenosine Receptor Agonists With Last‐Step Enzymatic 18F‐Labelling Potential (Fluorinase) for Positron Emission Tomography (PET)

本研究针对现有正电子发射断层扫描（PET）A2A受体显像剂仅为拮抗剂、无法特异性识别受体活性构象的瓶颈，开发了具有氟化酶介导末端18F标记潜力的新型A2A受体激动剂。研究人员通过合理药物设计合成系列化合物，证实其具有微摩尔级受体亲和力及激动剂特性，并成功实现酶促放射合成。该研究为开发能够特异性可视化GPCR活性状态的激动剂型PET示踪剂提供了新策略。

　　

腺苷A_2A受体作为G蛋白偶联受体家族的重要成员，广泛分布于人体各个组织，参与调控炎症反应、缺血再灌注损伤、中枢神经系统功能以及帕金森病等多种生理病理过程。然而，该受体在体内存在“活性”与“失活”构象的动态平衡，只有活性构象才能启动下游信号转导。目前，用于正电子发射断层扫描成像的A_2A受体靶向放射性示踪剂全部为拮抗剂，它们能够同等程度地结合受体的两种构象，因此只能反映受体的总体密度分布，无法区分其功能状态。开发能够选择性结合活性构象的激动剂型放射性示踪剂，对于深入理解A_2A受体的功能调控机制及其在疾病中的作用具有重要意义。

在这项发表于《European Journal of Organic Chemistry》的研究中，Nicolas Charalambous、Carina Schleidt、Rongfang Liu、Laura H. Heitman、Sergio Dall’Angelo、David O’Hagan和Phillip T. Lowe等人报告了一类新型A_2A受体激动剂，这些激动剂的设计巧妙结合了氟化酶底物与A_2A受体激动剂的共同结构特征，使其具备通过氟化酶进行最后一步酶促¹⁸F标记的潜力，从而为开发激动剂型PET示踪剂开辟了新途径。

研究人员采用的关键技术方法包括：基于结构活性关系的合理药物设计、多步有机合成构建目标化合物及其5'-氯代前体、氟化酶介导的转卤化反应（包括使用[¹⁹F]氟化物的“冷”标记实验和使用[¹⁸F]氟化物的放射化学合成）、以及使用表达人A_2A受体的HEK-293细胞膜进行的放射性配体置换实验（以[³H]ZM241385为放射配体），评估化合物的亲和力及其在氯化钠存在下的激动剂特性。

合成

目标化合物1、2和3及其相应的5'-氯代类似物（11、12、24）通过多步合成路线成功制备。其中，化合物2和3以2-碘腺苷为起始原料，经过5'-位氟化、Sonogashira交叉偶联等关键步骤构建。化合物1则通过2-氯腺苷与经过保护、Heck偶联、氢化脱保护等步骤制备的胺类侧链进行亲核取代反应获得。所有最终产物均通过半制备型高效液相色谱进行纯化。

氟化酶介导的转卤化反应

研究证实，5'-氯代类似物11、12和24均是氟化酶的良好底物。在含有KF和L-硒代蛋氨酸的磷酸缓冲液中，氟化酶能有效催化氯原子被氟原子取代的反应，生成相应的氟代产物2、3和1。高效液相色谱监测显示，对于11和12，反应在1小时内转化率即可达到约50%，24小时内基本完成。虽然24的转化速率相对较慢，但在4小时内也能达到50%的转化率，这可能与其C-2位胺基连接侧链的灵活性增加有关。

人腺苷A_2A受体放射性配体置换实验

放射性配体结合实验评估了化合物1、2、3对人A_2A受体的亲和力。结果表明，对位取代的化合物2亲和力较低，推测其末端苯乙酸部分可能与受体螺旋2发生空间冲突。相比之下，间位取代的化合物3表现出低微摩尔级的亲和力（K_i= 3.1 μM）。C-2位为胺基的化合物1也具有相似的亲和力（K_i= 1.3 μM），但两者均低于参考激动剂CGS21680（K_i= 0.3 μM）。在加入1 M氯化钠后，化合物1、3和CGS21680的亲和力均下降，这一现象符合激动剂与A_2A受体结合的特性，因为钠离子结合会稳定受体的失活构象，从而降低激动剂的结合。

¹⁸F标记激动剂3

作为原理验证，研究成功实现了氟化酶催化前体12与[¹⁸F]氟离子的转卤化反应，生成[¹⁸F]3。放射高效液相色谱和放射薄层色谱分析证实了放射性产物的生成，其保留时间与合成标准品一致。在30分钟和60分钟的反应时间内，均观察到了显著的放射化学转化率，表明该酶促方法能够在可行的反应时间内生成足量的放射性标记产物。

本研究成功地将氟化酶的底物特异性与A_2A受体激动剂的药效团要求相结合，设计并合成了一系列具有酶促¹⁸F标记潜力的新型A_2A受体激动剂。研究证实这些化合物能够与A_2A受体结合并表现出激动剂特性，并且其5'-氯代前体能够被氟化酶有效转化为相应的氟代产物。更重要的是，研究 exemplify了其中一种激动剂（[¹⁸F]3）的酶促放射合成，证明了该策略的可行性。这项工作标志着在开发能够特异性可视化GPCR活性状态的激动剂型PET示踪剂方面取得了重要进展。与传统的化学放射合成方法相比，氟化酶介导的标记策略具有条件温和（水相、中性pH）、无需保护/去保护步骤、无需干燥[¹⁸F]氟离子以及避免引入可能影响受体结合的庞大标记基团等优势。这为未来开发用于神经系统疾病等领域的A_2A受体功能成像探针奠定了坚实的基础。