《Food Chemistry》：Elucidation of calcium coordination mechanisms in cod bone-derived peptides and site-directed mutants using quantum chemistry
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Zearalenone (ZEN)检测方法研究：开发5G3单克隆抗体及IMB-ic-ELISA联用技术，检测限达0.05 ng/mL，在11种食品基质中灵敏度提升显著，玉米 grits达50倍。
刘文涛|周佳艺|邱金平|巴菊伟|王瑞|凌胡晓攀|李霞|卢阳|刘继峰
国家食品营养与安全重点实验室；天津科技大学食品科学与工程学院，天津300457，中国
摘要
玉米赤霉酮（ZEN）是一种由镰刀菌产生的霉菌毒素，常见于食品和动物饲料中，对人类和动物健康构成威胁。为了快速检测食品样本中的ZEN，本研究开发了一种单克隆抗体（mAb）5G3，并利用它创建了一种基于免疫磁珠（IMB）的免疫测定方法，该方法可用于多种食品中ZEN的富集、纯化和检测。分子识别显示mAb 5G3对ZEN及其五种代谢物具有广泛的特异性。在最佳工作条件下，间接竞争酶联免疫吸附测定（ic-ELISA）的灵敏度（IC50）为0.37?±?0.04?ng/mL，检测限（LOD，IC15）为0.05?±?0.01?ng/mL。使用ZEN IMBs进行纯化在11种食品基质中表现出优异的性能，检测限比传统稀释方法低1.42至50倍，尤其是在玉米碎粒中观察到显著的灵敏度提升（降低了50倍）。
引言
玉米赤霉酮（ZEN）是由镰刀菌产生的一种有毒次级代谢物。它通过与雌激素受体结合而引发类似雌激素的作用，对人类和动物健康构成潜在威胁（Mir等人，2025年）。ZEN的毒性作用包括生殖毒性、遗传毒性和免疫毒性（Bu等人，2022年；Rai等人，2020年）。不幸的是，食品和饲料中ZEN的污染在全球范围内普遍存在（Tolosa等人，2021年；Yang等人，2020年）。例如，根据Eskola等人（Eskola等人，2020年）的研究，欧洲食品安全局（EFSA）在2010年至2015年间收集的谷物样本中，约80%的样本受到玉米赤霉酮的污染。另一项研究调查了玉米及其衍生物中的ZEN污染情况，阳性率为94%，平均浓度为102.5?μg/kg（Han等人，2017年）。许多组织和国家已经制定了ZEN的最大残留限量（MRLs），以减少ZEN暴露对消费者的影响。在中国，玉米、小麦及其产品的ZEN限量设定为60?μg/kg（Zhang等人，2018年）。欧盟委员会为各种食品产品制定了详细的ZEN MRLs（欧盟委员会，2006年），范围从20到400?μg/kg。这些产品包括婴幼儿用的玉米加工产品（MRLs：20?μg/kg）、直接供人类食用的玉米及其加工产品（MRLs：100?μg/kg）、非直接面向最终消费者的其他玉米加工产品（MRLs：200?μg/kg）以及未加工的玉米粒（MRLs：350?μg/kg）和精炼玉米油（MRLs：400?μg/kg）等。因此，建立一种快速且灵敏的ZEN检测方法至关重要。
迄今为止，已经开发了几种ZEN定量方法，包括高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）（Y. Liu等人，2019年）、超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS/MS）（X. Wang & Li，2015年）、气相色谱-质谱（GC–MS）（Pack等人，2020年）、表面增强拉曼光谱（SERS）（Yin等人，2023年）、表面等离子体共振传感器（SPR）（?apar等人，2023年）和电化学传感器（ECL-ECR）（Luo等人，2023年）等。这些方法需要大型设备、专业操作人员以及耗时的样品预处理程序。此外，还提出了酶联免疫吸附测定（ELISA）（Huang等人，2023年）和侧向流动免疫层析测定（LFA）（Ganesan等人，2024年；Sun等人，2014年）用于食品中ZEN的分析。由于ELISA的简单性、低成本和高通量，它被广泛用于ZEN检测。样品预处理是检测过程中的关键步骤（Zhao等人，2023年）。有效的样品预处理可以从复杂的基质中富集目标分析物，并减少基质干扰，提高整个检测过程的效率和准确性（Zhao等人，2023年）。基于固相萃取（SPE）的净化程序已被广泛用于检测各种化合物，因为它们可以减少基质效应（Zhao等人，2023年）。然而，这些方法缺乏对目标物质的特异性且耗时较长。免疫亲和柱净化方法利用抗体和抗原之间的特异性可逆结合相互作用，从各种复杂基质溶液中特异性富集目标物质，并最小化基质效应，已被用作多种基质中霉菌毒素的标准样品预处理方法（Eskola等人，2020年；Zhao等人，2023年）。这些预处理过程包括复杂的、耗时的步骤，如过滤、氮气干燥和使用流动相重新溶解。
免疫磁珠（IMBs）是在磁珠表面修饰抗体或抗原的新型样品预处理材料（Chen等人，2022年；Wang, Niu等人，2022年）。基于IMBs的免疫磁分离（IMS）样品预处理方法有助于克服传统方法的局限性，并在近年来得到了广泛研究。IMBs比免疫亲和色谱（IAC）中使用的基质具有更大的比表面积和更好的分散能力，显著减少了平衡时间和堵塞的可能性（Wang, Liu等人，2022年）。在外加磁场的作用下，IMBs可以精确捕获并分离复杂样品基质中的目标物质。经过洗涤和洗脱后，可以快速获得目标物质进行检测，便于操作并减少样品预处理时间。IMS已被用于从各种样品基质中分离病原体（Chen等人，2022年）、病毒（Noh等人，2023年）、蛋白质（Tsai等人，2024年）和霉菌毒素（Deng等人，2017年）。此外，IMS还可以与其他测定方法结合使用，如HPLC（Y. Liu等人，2019年）、ELISA（Bai等人，2023年）和PCR（Noh等人，2023年）。
分子模拟技术可以通过计算和分析化合物的构象、电子和物理化学性质来有效分析结构类似物之间的差异（Yu等人，2023年）。此外，基于Alphafold（Jumper等人，2021年）和Antibody Grafting等程序的抗体同源建模可以揭示抗体-抗原复合物结合口袋中的关键残基和主要分子间力（Wang, Liu等人，2022年），这有助于进一步理解抗体的交叉反应性（CR）。然而，关于ZEN及其结构类似物和抗体识别机制的深入分析尚未报道。
在本研究中，使用羧甲基羟胺方法合成了ZEN半抗原（ZEN-羧甲基羟胺，或ZEN-CMO），并获得了一种针对ZEN及其主要结构类似物的单克隆抗体（mAb）。利用这种抗体，开发了一种基于IMS的免疫测定方法，用于快速样品预处理和多种食品基质中ZEN的分析。通过分子建模技术阐明了参与抗原-抗体结合及其相互作用的关键氨基酸残基，并描述了抗体识别ZEN及其结构类似物的机制。
材料与仪器
ZEN和T-2毒素从Pribolab公司（中国青岛）购买。玉米赤霉酮（ZAN）、α-玉米赤霉醇（α-ZEL）、β-玉米赤霉醇（β-ZEL）、α-玉米赤霉醇（α-ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-ZAL）、伏马菌素B1（FB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）、赭曲霉毒素A（OTA）、黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素M1（AFM1）、孕酮和己烯雌酚从天津Altascientific公司（中国天津）购买。O-羧甲基羟胺半盐酸盐（CMO）从TCI公司（日本）购买。
ZEN半抗原和蛋白结合物的表征
ZEN分子中含有C
O活性基团，因此通过羧甲基羟胺方法合成了半抗原。然后，通过羧基与载体蛋白氨基的共价偶联合成了完整的抗原。ZEN-CMO的相对分子量为约391.2，其质谱验证如图S2所示。合成产物通过高分辨率质谱正离子模式进行了表征。测得的分子量为
结论
本研究获得了一种抗ZEN单克隆抗体，并开发了基于该抗体的IMB纯化和ic-ELISA方法。该方法还使用11种不同类型的食品样本进行了验证。测试了三种不同品牌的玉米油样本，所有样本中都检测到了ZEN，最高含量为154.71?±?1.66?μg/kg，未超过欧盟的限值标准。抗体识别ZEN及其结构类似物的机制
CRediT作者贡献声明
刘文涛：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，方法学，资金获取，正式分析，概念化。周佳艺：撰写 – 审稿与编辑，可视化，调查，正式分析，数据管理。邱金平：调查，正式分析。巴菊伟：撰写 – 审稿与编辑，方法学，调查，数据管理。王瑞：正式分析。凌胡晓攀：正式分析。李霞：资金获取。卢阳：撰写 –
未引用的参考文献
Jeliazkov, Frick, Zhou和Gray, 2021
Liu等人，2021
Lyskov等人，2013
Ma等人，2025
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（编号：2020YFF0305002）、天津市食品质量与健康重点实验室开放项目（TJS202202）和天津市研究生科学研究创新项目（2021YJSS050）的资助。
