《Environment & Health》：Effects of Antibiotic-Induced Gut Microbiota Dysbiosis on Arsenic Bioaccumulation and Transformation in Mice and Its Potential Mechanisms
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本文通过建立头孢哌酮诱导的肠道菌群失调小鼠模型，系统揭示了肠道菌群在砷（As）代谢中的关键作用。研究发现，菌群失调显著降低了高剂量（10 mg/L）砷暴露下小鼠肝脏、脾脏、心脏、回肠及血液中的砷累积量，并改变了肝脏中砷形态（DMA(V)和As(V)）的比例。通过绝对定量分析，研究首次在鼠肠道中检测到17种砷生物转化基因（ABGs），并发现菌群失调导致其绝对丰度显著降低。关联分析预测了携带ABGs的特定细菌（如Bacteroides携带arsC基因），并揭示了菌群失调引发的代谢物（如氨基酸、脂肪酸酯）上调。该研究为理解肠道菌群介导的砷代谢机制及其在砷毒性评估中的意义提供了新视角。
引言
砷（As）是一种广泛存在于自然环境和食物中的致癌性类金属，长期暴露与多种健康问题相关。人体肠道内栖息着约1014个微生物，构成了一个高度多样化的生态系统，在宿主健康中扮演着至关重要的角色。越来越多的证据表明，肠道微生物群在摄入的砷化合物代谢以及抵抗砷诱导的毒性方面发挥着重要作用。然而，关于肠道菌群与砷相互作用的机制，特别是参与砷代谢的关键基因，目前仍知之甚少。
本研究旨在通过建立头孢哌酮诱导的肠道菌群失调小鼠模型，系统探究肠道菌群在砷生物累积、转化及排泄中的作用。研究假设，肠道菌群失调可能通过影响砷的转化过程，以及扰乱砷生物转化基因（ABGs）和代谢物的谱系，从而损害砷向血液、远端组织和粪便的转运。研究的主要目标包括：评估正常和紊乱肠道菌群介导的砷代谢差异；通过绝对定量分析评估不同肠道菌群对砷暴露的响应；确定小鼠体内ABGs的类型、数量和绝对丰度的差异；以及分析粪便中的非靶向代谢物谱。
材料与方法
小鼠模型与样本采集
研究选用雌性C57BL/6小鼠，随机分为六组：正常菌群组（Non_Cef）和菌群失调组（Cef），分别暴露于0、1和10 mg/L的砷（以亚砷酸钠形式）饮用水中。菌群失调组在砷暴露前3天通过饮水给予头孢哌酮（0.5 mg/mL）进行预处理。经过2周的砷暴露后，采集小鼠的血液、肝脏、肾脏、心脏、脾脏、回肠以及粪便样本，用于后续分析。
砷浓度与形态测定
采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定血液、组织和粪便中的总砷浓度。利用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术（HPLC-ICP-MS）对肝脏和肾脏中的砷形态进行分离和定量，包括As(V)、As(III)、二甲基砷酸（DMA(V)）和一甲基砷酸（MMA(V)）。
粪便DNA提取与测序
提取小鼠粪便样本的基因组DNA，通过Illumina Nova6000平台对细菌16S rRNA基因的V4-V5区域进行高通量测序。利用QIIME 2软件对测序数据进行处理，获得扩增子序列变体（ASVs），并使用SILVA数据库进行物种注释。
总细菌载量定量
采用qPCR技术，以16S rRNA基因为靶标，对粪便样本中的总细菌载量进行绝对定量。通过将各分类单元的相对丰度乘以总细菌载量，计算得到各细菌的绝对丰度。
ABGs的高通量定量PCR（HT-qPCR）
利用高通量定量PCR芯片（HT-qPCR）技术，检测小鼠粪便中19种ABGs的绝对丰度。该技术共设计了80对引物，覆盖了砷转运、As(III)氧化、As(V)还原以及砷（去）甲基化等四种类型的基因。
基于LC-MS的代谢组学
采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用技术（UHPLC-QE-MS）对粪便样本进行非靶向代谢组学分析，以探究肠道菌群代谢功能的改变。
结果
砷的生物累积、排泄与生物转化
在砷的生物累积方面，随着砷暴露剂量的增加，小鼠血液和各器官中的砷累积量均显著增加。在10 mg/L砷暴露组中，与正常菌群组（Non_Cef+As_10）相比，菌群失调组（Cef+As_10）小鼠的肝脏、脾脏、心脏、回肠和血液中的砷累积量分别显著降低了28.81%、27.94%、17.04%、60.68%和9.98%。在砷排泄方面，随着砷暴露剂量的增加，粪便中的砷浓度显著升高，但在正常菌群组和菌群失调组之间未观察到显著差异。
在肝脏的砷形态分析中，正常菌群组（Non_Cef）在砷暴露后，肝脏中MMA(V)的比例显著降低，而DMA(V)和As(V)的比例显著升高。在菌群失调组（Cef）中，DMA(V)是主要的砷形态，其比例在砷暴露后显著降低，而MMA(V)的比例显著降低。值得注意的是，在10 mg/L砷暴露组中，正常菌群组肝脏中的DMA(V)比例显著高于菌群失调组。在肾脏中，砷形态的分布未在正常菌群组和菌群失调组之间表现出显著差异。
小鼠肠道微生物群落
高通量测序分析显示，头孢哌酮处理和砷暴露显著改变了小鼠肠道菌群的结构。主坐标分析（PCoA）表明，正常菌群组和菌群失调组之间的肠道菌群存在显著分离。在菌群失调组中，总细菌载量低于正常菌群组，但差异不显著。线性判别分析（LDA）显示，菌群失调组中Enterococcus和Bacteroides等菌属显著富集，而Allobaculum和Lactobacillus等菌属几乎完全消失。
ABGs的多样性与丰度
研究共在小鼠肠道中检测到17种ABGs。在10 mg/L砷暴露组中，菌群失调组（Cef+As_10）的ABGs平均数量显著低于正常菌群组（Non_Cef+As_10）。在绝对丰度方面，菌群失调组（Cef+As_10）的ABGs绝对丰度最低，显著低于正常菌群组（Non_Cef+As_10）。其中，arsC、arsH、arsB和aoxB基因的绝对丰度最高。主成分分析（PCA）表明，正常菌群组和菌群失调组的ABGs谱系存在显著分离。
关联分析显示，几乎所有ABGs均与属水平上的肠道菌群呈显著正相关。例如，arsI基因与unclassified_f_Muribaculaceae和Lachnospiraceae_NK4A136_group呈正相关；arsB基因与Allobaculum、Lactobacillus、unclassified_o_Clostridia_UCG-014和Odoribacter呈正相关；aoxS、aoxC和aoxA基因与unclassified_f_Muribaculaceae、Allobaculum、Lactobacillus和unclassified_o_Clostridia_UCG-014呈正相关；arsR和arsC基因与unclassified_f_Muribaculaceae、unclassified_f_Lachnospiraceae和Alistipes呈正相关。
肠道微生物代谢谱
正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示，正常菌群组和菌群失调组之间的肠道代谢物谱存在显著差异。火山图分析表明，头孢哌酮处理显著扰动了小鼠肠道的代谢谱，共鉴定出161种差异代谢物，其中146种上调。这些差异代谢物主要被归类为“氨基酸、肽及其类似物”以及“碳水化合物和碳水化合物结合物”。在10 mg/L砷暴露组中，菌群失调组（Cef+As_10）与正常菌群组（Non_Cef+As_10）相比，差异代谢物主要为“氨基酸、肽及其类似物”和“有机杂环化合物”。
讨论
本研究通过建立头孢哌酮诱导的肠道菌群失调小鼠模型，系统报道了正常和紊乱肠道菌群在砷暴露下的代谢差异。研究发现，在10 mg/L砷暴露下，菌群失调显著降低了小鼠血液和组织中的砷累积量，并改变了肝脏中砷形态的比例。通过绝对定量分析，研究首次揭示了小鼠肠道中ABGs的分布，并发现菌群失调导致其绝对丰度显著降低。此外，头孢哌酮处理和砷暴露均显著扰动了肠道代谢物谱。
研究结果表明，肠道菌群失调可能通过降低肠道菌群对砷的生物转化能力，以及削弱肠上皮细胞对砷的转运能力，从而减少砷向远端组织和血液的转运。同时，菌群失调导致的ABGs丰度降低，特别是与As(V)还原和As(III)氧化相关的基因，可能影响了砷在肠道内的转化过程，进而改变了其在体内的累积和分布。关联分析进一步揭示了ABGs与特定肠道菌群之间的密切联系，表明这些基因可能由特定的细菌携带，并在砷的解毒过程中发挥关键作用。此外，菌群失调引发的代谢物谱改变，如氨基酸和脂肪酸酯的上调，可能通过影响肠道屏障功能，间接影响了砷的吸收和代谢。
结论
本研究首次采用绝对定量分析方法，探究了头孢哌酮预处理条件下肠道菌群及其代谢物对砷暴露的响应。研究首次揭示了小鼠肠道中17种ABGs的多样性，并初步预测了可能携带这些基因的肠道菌群。研究结果表明，在10 mg/L砷暴露下，菌群失调降低了小鼠器官和血液中的砷累积量。头孢哌酮处理和砷暴露显著改变了ABGs、肠道菌群及其代谢物的谱系。关联分析表明，携带ABGs的肠道菌群可能在保护宿主免受砷毒性方面发挥重要作用。理解肠道菌群中ABGs在代谢摄入砷中的作用，对于评估砷暴露对人类健康的长期影响具有重要意义。
