细胞色素c氧化酶亚基COX4-1通过线粒体重编程将Erastin诱导的细胞死亡从铁死亡转向凋亡

《Antioxidants》：Cytochrome c Oxidase Subunit COX4-1 Reprograms Erastin-Induced Cell Death from Ferroptosis to Apoptosis: A Transmitochondrial Study

本研究通过CRISPR构建的POLG敲除ρ0细胞和线粒体胞质杂合体（Cybrid）技术，揭示了线粒体细胞色素c氧化酶（CcO）亚基COX4-1在胶质母细胞瘤（GBM）中的关键作用。研究发现，富含COX4-1的线粒体通过恢复CcO活性、降低不稳定铁（LIP）水平、减少胱氨酸摄取以及下调SLC7A11和GPX4表达，将Erastin诱导的细胞死亡从铁死亡（Ferroptosis）重编程为凋亡（Apoptosis），从而阐明了线粒体亚基特异性组成是调控细胞死亡命运的一个先前未被认识的分子决定因素。

　　

文章内容总结

1. 引言

铁死亡（Ferroptosis）是一种铁依赖性的、氧化性的调节性细胞死亡形式，已成为胶质母细胞瘤（GBM）的治疗弱点。然而，控制铁死亡敏感性的线粒体决定因素仍然定义不清。细胞色素c氧化酶（Cytochrome c oxidase, CcO/Complex IV）是线粒体呼吸的关键调节因子，包含两种亚基IV（COX4）亚型：COX4-1（一种持家亚型）和COX4-2（一种应激诱导的变体）。先前的研究发现，COX4-1的表达保护胶质瘤细胞免受Erastin诱导的铁死亡，这表明线粒体独立于经典的铁死亡调节因子影响细胞死亡决策。为了分离线粒体对铁死亡敏感性的贡献，本研究采用了CRISPR生成的POLG敲除ρ⁰细胞和线粒体胞质杂合体（Cybrid）技术。

2. 材料与方法

研究使用人胶质瘤细胞系U251。通过CRISPR/Cas9技术敲除编码DNA聚合酶δ催化亚基的基因（POLG），生成线粒体DNA耗竭的ρ⁰细胞。通过将ρ⁰细胞与过表达COX4-1或COX4-2的转基因U251细胞的去核胞质体融合，构建了线粒体胞质杂合体。通过PCR扩增线粒体COXI基因和核基因ACTIN，验证了线粒体DNA的耗竭和恢复。通过Western Blot检测了COX4-1、COX4-2、POLG、柠檬酸合酶（CS）、SLC7A11、GPX4和ACTB的蛋白表达。通过酶活性测定评估了CcO活性。使用Monochlorobimane（MCB）探针测定谷胱甘肽（GSH）含量。使用高灵敏度DCFH-DA探针测定细胞内活性氧（ROS）水平。使用FerroOrange探针通过流式细胞术测定不稳定铁（LIP）水平。使用BODIPY 581/591 C11探针通过流式细胞术测定脂质过氧化水平。使用Annexin V/PI染色通过流式细胞术评估细胞凋亡。

3. 结果

3.1. ρ⁰细胞和线粒体胞质杂合体的生成与表征

通过CRISPR基因编辑成功生成了U251 POLG敲除细胞（克隆3-03和2-06），Western Blot证实了POLG蛋白表达的缺失，PCR扩增证实了线粒体COXI基因的耗竭。CcO酶活性测定显示，两个ρ⁰克隆均完全丧失了CcO活性。通过将ρ⁰细胞与过表达COX4-1或COX4-2的胞质体融合，成功构建了线粒体胞质杂合体。PCR分析证实了COXI扩增的恢复。Western Blot分析显示，COX4-1和COX4-2胞质杂合体分别表达了相应的COX4亚型。酶活性测定显示，COX4-1和COX4-2胞质杂合体的CcO活性水平分别与其各自的亲本细胞相当，且COX4-2表达细胞的CcO活性比COX4-1表达细胞低约10倍。

3.2. COX4-1表达胞质杂合体对Erastin敏感，但表现出不稳定铁、胱氨酸摄取以及SLC7A11和GPX4表达降低

细胞活力测定显示，Erastin以剂量依赖的方式抑制COX4-1表达亲本细胞和胞质杂合体（克隆1和6）的存活，其半数抑制浓度（IC₅₀）分别为2.11 μM、4.48 μM和6.29 μM。相比之下，Erastin在COX4-2表达细胞中未诱导显著的毒性。Western Blot分析显示，COX4-2表达亲本细胞和胞质杂合体中SLC7A11表达较高，而COX4-1表达细胞中SLC7A11几乎检测不到。此外，COX4-1表达细胞中GPX4的表达也显著低于COX4-2表达细胞。与这些发现一致，COX4-2表达细胞的胱氨酸摄取量显著高于COX4-1表达细胞。流式细胞术分析显示，COX4-1表达亲本细胞、胞质杂合体1和胞质杂合体6的不稳定铁水平分别比COX4-2表达亲本细胞低11.2倍、10.7倍和23.4倍。这些结果表明，线粒体而非核背景，控制着铁死亡相关因子的水平以及对Erastin的反应。

3.3. Erastin促进COX4-1表达胞质杂合体中GSH耗竭和氧化应激

GSH含量测定显示，Erastin使COX4-1表达亲本细胞和胞质杂合体中的GSH含量降至对照水平的约38-40%。相比之下，COX4-2表达细胞在Erastin暴露后GSH水平基本保持不变。使用高灵敏度DCFH-DA探针测定细胞内ROS水平，发现在细胞死亡尚不明显时（处理6小时后），Erastin在COX4-1表达亲本细胞和胞质杂合体中诱导了剂量依赖性的ROS增加，但在COX4-2表达细胞中未观察到这种效应。这些发现表明，Erastin选择性地促进COX4-1表达细胞中的GSH耗竭和氧化应激。

3.4. Erastin在COX4-1表达胞质杂合体中诱导凋亡而非铁死亡

Annexin V/PI染色分析显示，在COX4-1表达细胞中，Erastin处理使Annexin V/PI阳性细胞的比例从约30%显著增加至50%。相比之下，在相同条件下，COX4-2表达细胞未显示凋亡变化。使用凋亡诱导剂ABT-737作为阳性对照，证实两种细胞系及其胞质杂合体均对凋亡高度敏感，表明Erastin的效应是COX4-1表达细胞特异性的。脂质过氧化测定显示，在Erastin处理后，COX4-1和COX4-2表达细胞中均几乎未检测到脂质过氧化，而使用叔丁基过氧化氢（t-BHP）处理的所有细胞均显示出脂质过氧化。这些结果表明，Erastin在COX4-1表达细胞中主要诱导凋亡性而非铁死亡性细胞死亡。

4. 讨论

本研究利用CRISPR介导的POLG敲除和线粒体胞质杂合体技术，建立了线粒体组成与胶质母细胞瘤中氧化还原依赖性细胞死亡途径之间的直接机制联系。研究结果表明，COX4亚型背景是胶质瘤细胞中Erastin敏感性和氧化还原调节细胞死亡的关键决定因素。COX4-1表达细胞对Erastin敏感，但经历的是凋亡而非铁死亡。相反，COX4-2表达细胞对Erastin具有抗性，并表现出铁死亡耐受的特征。COX4-1表达细胞中观察到的GPX4和SLC7A11表达降低以及不稳定铁水平降低，可能解释了这种凋亡表型，因为这些基因对于缓冲氧化应激和维持氧化还原稳态是必需的。这些发现揭示了线粒体亚基特异性组成是调控细胞死亡命运的一个先前未被认识的分子决定因素。

5. 结论

本研究支持一个模型，即COX4亚型身份控制着线粒体呼吸、铁处理和氧化还原调节之间的平衡，最终决定了胶质瘤细胞在Erastin作用下是经历凋亡还是铁死亡。含有COX4-1的线粒体通过恢复细胞色素c氧化酶活性，并重编程铁和氧化还原代谢，从而抑制Erastin诱导的铁死亡并促进凋亡性细胞死亡。