天竺葵（Cymbopogon martini）精油及其主要成分香叶醇对呼吸道及皮肤软组织感染临床分离菌株的抗菌活性研究

《Pharmaceutics》：Antibacterial Activity of Palmarosa (Cymbopogon martini (Roxb.) Will.Watson) Essential Oil and Geraniol Against Clinical Isolates from Respiratory, Skin, and Soft Tissue Infections

本文研究了天竺葵（Cymbopogon martini）精油及其主要成分香叶醇（Geraniol）对呼吸道、皮肤及软组织感染临床分离菌株的抗菌活性。研究通过测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）评估其抗菌效果，并利用MTT法检测其对哺乳动物肝细胞（HepG2）的细胞毒性（CC50）。结果表明，该精油对多种革兰氏阳性菌（如链球菌、葡萄球菌）及部分革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、卡他莫拉菌）具有显著抗菌活性，且其细胞毒性低于香叶醇，展现了其在应对抗菌素耐药性（AMR）方面的潜在应用价值。

　　

引言

精油是通过水蒸气蒸馏、机械压榨或干馏从芳香植物中获得的天然产物，其特点是含有多种挥发性化合物，主要属于单萜类。近年来，研究强调了这些产品的生物活性特性，即其抗炎、抗菌和抗真菌特性。只有一小部分已知植物物种被归类为芳香植物，它们主要集中在某些植物科中，如唇形科、芸香科、桃金娘科或禾本科。

禾本科的香茅属（Cymbopogon）物种在亚洲、南美洲和非洲的传统医学中有着悠久的历史，其叶片和其他部分被用于草药茶或煎剂。传统上，该属植物被用于治疗发烧、呼吸道感染或消化性和炎症性疾病。天竺葵（Cymbopogon martini），俗称Palmarosa，在印度种植以获取其精油，富含单萜和单萜醇，如香叶醇，约占其成分的75-80%。天竺葵精油在古代印度和东南亚传统医学中被广泛使用，并在近年来的研究中显示出显著的生物学特性。该精油已被证明可以减轻皮肤炎症，并表现出抗氧化和抗遗传毒性活性。此外，它还對多种病原体表现出抗菌活性，包括马拉色菌和白色念珠菌等真菌，如表皮葡萄球菌等细菌，以及如雷氏扇头蜱等螨虫。香叶醇也表现出显著的生物活性特性，对多种细菌物种具有抗菌活性，包括大肠杆菌、幽门螺杆菌、流感嗜血杆菌和肺炎链球菌。除了其抗菌作用外，香叶醇还显示出广谱的抗真菌活性，进一步支持其作为多功能抗菌化合物的潜力。除了其抗菌潜力外，据报道该化合物还能调节关键的炎症和抗氧化信号通路，并且还显示出显著的镇痛活性。此外，多个行业，特别是香料行业，将香叶醇用作高价值的 scent 化合物，突显了其在天竺葵精油中丰度的重要性。

抗菌素耐药性代表了一个迅速扩大的全球性挑战，原因是细菌、真菌、病毒或寄生虫能够抵抗抗菌治疗。特别是，抗生素耐药性涉及细菌对抗生素治疗的敏感性降低或完全耐药。这种现象涉及多种机制，包括药物的酶失活、渗透性降低、抗菌靶点的修饰以及外排泵活性增强，从而导致高水平的药物排出。据估计，细菌感染每年导致约770万人死亡，其中约495万与耐药病原体有关，127万直接归因于对现有抗生素不再有反应的细菌。此外，几位作者预计，这些死亡率水平在未来几十年将继续上升，反映了抗菌素耐药性的全球负担。世界卫生组织认识到这个问题是全球健康十大威胁之一。2024年发布了细菌优先病原体清单的更新版本，重点介绍了对全球健康构成严重威胁的抗生素耐药性细菌。在该分类中，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌被列为高度优先病原体，反映了它们巨大的临床负担，重点强调了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌。链球菌属，包括大环内酯类耐药A组链球菌、大环内酯类耐药肺炎链球菌和青霉素耐药B组链球菌，被归类为中度优先病原体。这强调了迫切需要加强感染预防策略、持续监测和创新的抗菌药物开发。在这种背景下，传统上用于治疗传染病的天然产物作为新型抗菌化合物的潜在来源重新获得了科学界的兴趣。

鉴于香茅属物种在治疗感冒、喉咙痛和气管炎方面的传统用途，本工作的目的是研究天竺葵精油对呼吸道细菌分离株的抗菌特性。由于该精油也适用于局部应用并具有抗炎特性，因此也评估了其对皮肤分离株的影响。将产品的效果与其主要成分香叶醇的效果进行了对比，同时还评估了两种样品对哺乳动物肝细胞的影响。

材料与方法

精油

天竺葵精油由Pranar?m（比利时吉斯兰吉安）提供，该公司也提供了其主要特性的描述。该精油通过水蒸气蒸馏获得；批次号为OF012293，来自印度的一种天竺葵变种motia的地上部分。精油在室温下避光保存。储备溶液在使用前立即制备。供应商还在标准化条件下进行了气相色谱-质谱联用分析。色谱分析使用配备有5SilMS 60-0.25-0.25柱的TSQ92105012仪器进行。温度程序包括在40°C下初始保持2分钟，然后以5°C/分钟的线性升温至320°C，最后保持10分钟。氦气作为载气，恒定压力为3.2 bar。该方法允许的检测限为0.01%，确保了灵敏和可重复的定量。精油中鉴定出的主要化合物的化学结构可见图1。色谱图见补充材料。

表1. 供应商提供的天竺葵精油植物化学谱。

图1. （a）香叶醇（分子量：154.25 g/mol）和（b）乙酸香叶酯（分子量：196.29 g/mol）的分子结构。

测试微生物

人类临床细菌分离株来自皮肤、软组织以及上呼吸道和下呼吸道。所有菌株均在Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa的微生物实验室分离和鉴定。鉴定使用MALDI Biotyper Sirius系统进行。详细说明临床分离株抗菌素耐药性的抗菌谱图见补充材料。

抗菌活性

最低抑菌浓度（MIC）

使用96孔板中的肉汤微量稀释法测定精油和从Sigma-Aldrich购买的香叶醇的MIC。将细菌预培养物孵育至0.5麦氏浊度。从该悬浮液中取10 μL加入96孔板，孔中含有190 μL的胰蛋白酶大豆肉汤或补充了3%裂解马血的Mueller-Hinton肉汤培养基，根据细菌需求而定。样品事先用二甲基亚砜作为助溶剂溶解在培养基中。同时制备阴性对照和溶剂对照。将板在37°C下孵育过夜，MIC定义为未见可见细菌生长（表现为无浊度）的最低抗菌浓度。制备对照板以验证细菌浓度。包括三个独立重复。

最低杀菌浓度（MBC）

为评估MBC，将孔中的等分试样在胰蛋白酶大豆肉汤或补充了3%裂解马血的Mueller-Hinton肉汤中稀释，并铺在Mueller-Hinton琼脂或巧克力琼脂平板上。将平板孵育过夜，计数菌落以计算MBC，MBC定义为导致细菌生长减少99.9%的最低浓度。所有实验进行三次。MBC/MIC比值≤4定义为杀菌活性，而MBC/MIC比值>4被认为是抑菌活性的指标。

细胞毒性

使用源自人肝细胞癌的HepG2细胞评估天竺葵精油的潜在细胞毒性作用。该细胞系从美国模式培养物集存库获得，维持在由Gibco提供的Dulbecco改良Eagle培养基中，该培养基补充了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。细胞在37°C、含5% CO₂的湿润气氛中孵育。

使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）测定法测定细胞毒性。简而言之，在96孔板中每孔接种2×10⁴个细胞，并让其贴壁24小时。然后用含有不同浓度精油或香叶醇的Dulbecco改良Eagle培养基替换原有培养基。对照孔仅接收不含提取物的培养液。细胞暴露于处理24小时。

孵育后，每孔加入100 μL MTT溶液（0.4 mg/mL），并将板在黑暗中孵育2小时。形成甲臜结晶后，小心移除MTT溶液，并将结晶溶解在二甲基亚砜中。使用Synergy H1混合多功能读数器在550 nm处测量吸光度。所有实验至少进行三次。同时测定了50%细胞毒性浓度（CC₅₀）。

统计分析

使用GraphPad Prism 10进行统计分析。Grubbs检验用于识别显著异常值。为了将测试的不同浓度与未处理条件或对照进行比较，进行了单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett事后检验。CC₅₀值也通过GraphPad Prism 10的非线性回归计算。对细菌分离株获得的MIC和MBC值进行描述性分析。

结果

抗菌活性

表2显示了精油和香叶醇对不同细菌分离株的抗菌潜力。对于革兰氏阳性菌，天竺葵显示出MIC值范围在125至300 μg mL^?1之间，MBC值在250至500 μg mL^?1之间。MIC较低的分离株是无乳链球菌和咽峡炎链球菌，两者的MIC均为125 μg mL^?1，MBC为250 μg mL^?1，而纯化合物显示出更高的值。对于两种化脓性链球菌分离株，精油显示的MIC和MBC值均为250 μg mL^?1，而香叶醇的值无法计算。天竺葵精油对两种测试葡萄球菌属物种的MIC和MBC值分别为300和400 μg mL^?1。

表2. 天竺葵精油和香叶醇对临床分离株的抗菌作用，以MIC和MBC（μg mL^?1）值表示。所有实验进行三次，每次测定包括至少三个技术重复。报告值对应于所得结果的平均值。MIC和MBC值的标准偏差未在表中显示，因为这些终点是在离散浓度步骤中确定的，并且在重复中获得相同的值。

对于革兰氏阴性菌，精油和香叶醇的MIC和MBC值较高，从分别为250和300 μg mL^?1到高于1000 μg mL^?1的值，因此未测定。最低的MIC值是为卡他莫拉菌确定的（天竺葵，250 μg mL^?1；香叶醇，300 μg mL^?1）。测试的产品均对铜绿假单胞菌分离株无活性（MIC > 1000 μg mL^?1）。产酸克雷伯菌和木糖氧化无色杆菌是仅有的香叶醇的MIC和MBC值（300 μg mL^?1）低于精油（450 μg mL^?1）的分离株。对于两种大肠杆菌分离株，精油的MIC值（手术伤口为400 μg mL^?1；气管吸出物为350 μg mL^?1）低于香叶醇（500 μg mL^?1）。由于所有显示活性的菌株的MBC/MIC比值均<4，因此认为精油和香叶醇对这些分离株具有杀菌作用。

对哺乳动物细胞的影响

精油和香叶醇在62.5至500 μg mL^?1浓度范围内对哺乳动物细胞的影响如图2所示。天竺葵精油在测试的最高浓度500 μg mL^?1下显著降低了HepG2细胞的活力（活力为75.64%；p < 0.05）。香叶醇在250 μg mL^?1和500 μg mL^?1浓度下也显著降低了活力。精油显示出比在相同条件下测试的纯化合物更高的CC₅₀值（761 ± 69 μg mL^?1对205 ± 8 μg mL^?1）。

图2. 天竺葵精油和香叶醇在暴露于不同浓度（从31.25 μg mL^?1到500 μg mL^?1）24小时后对HepG2细胞的影响，使用MTT法测定。所有数据均相对于未处理的对照组进行标准化。数据表示为来自三个独立实验的平均值±SEM，每个实验进行三次。统计学显著性通过单因素ANOVA确定（统计学显著性：* p < 0.05；** p < 0.01）。使用比所示范围更高的浓度范围（62.5至1000 μg mL^?1）来确定CC₅₀值。CC₅₀值通过非线性曲线拟合后的回归分析获得。天竺葵精油CC₅₀= 761 ± 69 μg mL^?1。香叶醇CC₅₀= 205 ± 8 μg mL^?1。

讨论

天竺葵精油在多个行业，包括香水、化妆品、农产品和制药行业，具有相当大的商业相关性，因其持久的玫瑰样香味增强了产品质量和消费者接受度。此外，由于其高香叶醇含量，它也被认为是一种有价值的产品。在天竺葵油中，香叶醇是主要成分，占挥发性部分的82.83%。其他发现的化合物是乙酸香叶酯（7.21%）、芳樟醇（7.71%）和β-石竹烯（1.89%）（表1）。该组成与之前的报告一致。

香叶醇是一种单萜醇，用于商业配方，特别是在化妆品和家用产品行业中。该化合物是许多精油（如丹尼斯百里香、柠檬非洲豆蔻、某些电芋属植物或香茅属的精油）的天然成分。此外，最近的报告强调了其抗菌特性，与本工作的结果一致（表2）。表2显示了油和香叶醇对不同细菌分离株的抗菌潜力。令人惊讶的是，该油对链球菌属显示出潜力，对无乳链球菌和咽峡炎链球菌的MIC值为125 μg mL^?1，对停乳链球菌和两种化脓性链球菌分离株的MIC值为250 μg mL^?1。该属包括一百多种在人类和动物粘膜表面定殖的微生物物种。仅化脓性链球菌每年就导致约7亿感染，而无乳链球菌与流产、早产和严重的新生儿感染（如败血症、肺炎和脑膜炎）有关。咽峡炎链球菌通常是口腔、胃肠道和泌尿生殖道的共生菌，常参与脓肿和其他化脓性感染，最近的研究表明该物种通过慢性胃炎症和癌症进展与胃癌发生有关。据我们所知，这是关于天竺葵精油对这些细菌影响的首次报告。对于香叶醇，结果与先前研究该纯化合物对化脓性链球菌潜力的报告一致。该油和香叶醇也对金黄色葡萄球菌具有活性，与之前的报告一致。

大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，是正常肠道微生物群的一部分。然而，在某些条件下，它可以作为机会性病原体，能够引起胃肠道以外的严重感染。在本研究中，分离株来自气管吸出物和手术伤口样本。在皮肤伤口中，大肠杆菌可能导致皮肤和软组织感染，并可能进展为危及生命，特别是在免疫功能低下的患者中。在气管吸出物中检测到大肠杆菌也很重要，因为该生物体可作为下呼吸道感染（包括呼吸机相关性肺炎）的病原体。此外，此类分离株通常表现出多重耐药性和复杂的毒力特征，构成重大的治疗挑战。在这项工作中，油和香叶醇对大肠杆菌显示出效果，对手术伤口和气管吸出物样本的MIC值分别为400 μg mL^?1和350 μg mL^?1。

天竺葵还对临床环境中其他相关的革兰氏阴性菌具有活性，即摩根氏菌（MIC 350 μg mL^?1；MBC 500 μg mL^?1）、卡他莫拉菌（MIC 250 μg mL