蓝藻噬菌体MaMV-DC中类孔蛋白ORF70的鉴定与功能表征：揭示噬菌体裂解宿主细胞的新机制

《Marine Drugs》：Identification and Characterization of Holin-like Protein ORF70 from Cyanophage MaMV-DC

本文系统鉴定了蓝藻噬菌体MaMV-DC中的类孔蛋白（Holin-like protein）ORF70，通过生物信息学分析、亚细胞定位、能量毒素（DNP）敏感性测试、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）渗漏实验及透射电镜（TEM）观察，证实其具有典型的III类孔蛋白特征。研究表明，ORF70通过定位于细胞膜并诱导膜去极化，破坏宿主细胞膜完整性，从而发挥杀菌裂解活性，为开发基于噬菌体的新型抗菌疗法提供了理论依据。

　　

1. 引言

蓝藻作为地球上最古老的光合细菌之一，在水生生态系统中扮演着至关重要的角色，不仅负责氧气生产，还参与氮和二氧化碳的固定。而蓝藻噬菌体（Cyanophages）作为感染蓝藻的病毒，通过诱导宿主细胞裂解，在调控蓝藻水华、塑造宿主群落结构及影响营养循环方面发挥着关键作用。噬菌体通常采用“孔蛋白-内溶素（Holin-endolysin）”系统来裂解宿主细胞。其中，孔蛋白（Holin）是一种小的疏水性膜蛋白，在感染后期于宿主细胞质膜上形成非特异性孔洞或损伤，从而允许内溶素（Endolysin）进入周质空间，降解肽聚糖层，最终导致宿主细胞裂解。

根据蛋白质结构和跨膜结构域（Transmembrane Domains, TMDs）的数量，孔蛋白可分为三类：I类（>95个氨基酸，3个TMDs）、II类（65-95个氨基酸，2个TMDs）和III类（1个TMD）。尽管来自金黄色葡萄球菌噬菌体GH15、沙门氏菌噬菌体P22等噬菌体的内溶素和孔蛋白已被广泛研究作为潜在的抗菌剂，但关于蓝藻噬菌体中同源蛋白的研究仍然有限。本研究旨在对蓝藻噬菌体MaMV-DC中的类孔蛋白ORF70进行鉴定与功能表征，以期为开发新型抗菌疗法提供理论依据。

2. 结果

2.1. ORF70的鉴定与序列分析

ORF70被鉴定为MaMV-DC中的一个推定的类孔蛋白。该基因长度为405 bp，编码一个由134个氨基酸组成的蛋白质，预测分子量为15.4 kDa，理论等电点（pI）为5.86。二级结构分析显示，ORF70蛋白包含4个α-螺旋和8个β-折叠。信号肽预测结果表明，ORF70不含信号肽。跨膜结构预测进一步揭示，ORF70含有一个单一的疏水性跨膜结构域（TMD），其跨膜螺旋区域位于第2至第24位氨基酸残基之间，C端位于细胞外。基于其预测的结构特征，ORF70被认为是一个具有III类孔蛋白特征的类孔蛋白。

2.2. ORF70的亚细胞定位

为了验证ORF70的膜定位特性，研究人员构建了C端融合sGFP的重组蛋白ORF70-G，并在大肠杆菌（E. coli）中进行表达。荧光显微镜观察结果显示，表达GFP的对照菌株中荧光信号均匀分布，而表达ORF70-GFP融合蛋白的BL21细胞中，荧光信号微弱地定位于细胞外周。为了进一步确认其膜定位，研究人员将ORF70表达为C端His标签融合蛋白（ORF70-His），并通过Western blot分析细胞质和膜组分。结果显示，ORF70-His在膜组分中被检测到，而对照蛋白（32a-His）则主要位于细胞质中。这些发现为ORF70作为膜相关蛋白的分类提供了支持证据。

2.3. 能量毒素测试分析

噬菌体孔蛋白通过使细胞膜去极化来诱导细菌裂解。2,4-二硝基苯酚（2,4-dinitrophenol, DNP）等能量毒性化合物可促进膜去极化，导致膜损伤提前形成。因此，对DNP的敏感性是孔蛋白活性的关键指标。研究结果表明，10 mmol/L的DNP诱导了膜去极化，增强了ORF70在大肠杆菌中的生长抑制效应。具体而言，在DE3: pET-21a-ORF70菌株中，加入DNP加速了IPTG诱导后一小时内观察到的细胞密度下降。这些发现证实了ORF70对DNP敏感，并能诱导早期膜去极化，支持了ORF70作为类孔蛋白的分类。

2.4. ORF70对大肠杆菌生长的抑制作用

为了评估ORF70是否表现出预期的孔蛋白裂解活性，研究人员检测了其表达对大肠杆菌生长的影响。结果显示，在IPTG诱导2小时后，表达ORF70的DE3: pET21a-ORF70菌株的OD₆₀₀显著下降，表明ORF70具有杀菌效应。此外，β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）检测显示，ORF70表达后细胞外β-半乳糖苷酶水平升高，表明ORF70诱导了细胞膜损伤，导致细菌生长抑制。活/死染色（Live/dead staining）结果显示，表达ORF70的大肠杆菌细胞发出红色荧光，表明细胞死亡，而对照菌株则无此现象。活/死染色结果的定量分析显示，与DE3: pET-21a对照组相比，DE3: pET-21a-ORF70菌株的死细胞比例显著更高。这些结果共同证明，ORF70不仅抑制大肠杆菌生长，还引起膜损伤，导致细菌细胞死亡。

2.5. ORF70通过引起膜损伤发挥杀菌裂解活性

为了探究ORF70抑制大肠杆菌生长的机制，研究人员通过革兰氏染色和透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察了ORF70过表达诱导的形态学变化。表达ORF70的大肠杆菌细胞显示出模糊的细胞边界、细胞壁与膜之间轻微收缩以及细胞外观变浅。相比之下，对照细胞（DE3: pET-21a）保持了正常的形态，具有完整的膜、清晰的细胞壁和致密的细胞内容物。这些数据表明，MaMV-DC的ORF70可能参与了膜扰动，支持了其潜在的类孔蛋白功能。

3. 讨论

本研究对蓝藻噬菌体MaMV-DC中的类孔蛋白ORF70进行了表征，揭示了其在噬菌体介导的宿主细胞裂解中的作用。ORF70编码的蛋白质表现出与III类孔蛋白一致的几个关键特征，包括含有一个疏水性跨膜结构域，这是孔蛋白的定义特征。亚细胞定位研究表明ORF70是膜相关的，这支持了其作为类孔蛋白的分类。这种膜关联性对其杀菌裂解活性至关重要，因为孔蛋白通过破坏宿主细胞膜，形成损伤，从而促进内溶素向细胞壁的转运，导致细胞裂解。

ORF70的潜在杀菌裂解活性通过生长曲线测量和β-半乳糖苷酶渗漏实验得到了证实。ORF70在大肠杆菌中的过表达导致细菌生长显著减少，同时细胞外培养基中β-半乳糖苷酶活性增加，这是膜损伤的标志。活/死染色结果提供了表达ORF70的细菌培养物中细胞死亡的视觉确认，显著比例的细胞表现出红色荧光，表明膜完整性受损。

ORF70对能量毒素2,4-二硝基苯酚（DNP）的敏感性进一步支持了其类孔蛋白活性。孔蛋白已知与能量毒素相互作用，促进膜去极化并促进其杀菌功能。研究结果表明，添加DNP加速了大肠杆菌的生长抑制，表明ORF70诱导了膜去极化，这是裂解过程中的关键步骤。这一发现为ORF70作为类孔蛋白的功能提供了额外的证据，该蛋白通过膜破坏导致细菌细胞死亡。

透射电子显微镜（TEM）和革兰氏染色进一步揭示了ORF70诱导的形态学变化。表达ORF70的大肠杆菌细胞表现出显著的细胞形态改变，包括模糊的细胞边界和膜收缩。这些变化是孔蛋白引起的膜损伤的特征。观察到的形态缺陷与孔蛋白已知的杀菌裂解活性一致，孔蛋白在宿主膜上形成孔洞或损伤，导致细胞死亡和细胞内含物的释放。

本研究有助于扩展对蓝藻噬菌体生物学的认识以及孔蛋白在噬菌体-宿主相互作用中的作用。虽然现有研究大多集中在感染革兰氏阳性菌的噬菌体的孔蛋白-内溶素系统上，但很少有研究探索蓝藻噬菌体的孔蛋白。我们的发现提供了ORF70作为类孔蛋白的功能表征，并暗示了其在噬菌体介导的宿主细胞裂解中的潜在作用。然而，应该指出的是，铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）FACHB-524缺乏可用的基因操作系统，这目前阻止了ORF70在该蓝藻宿主中的异源表达和进一步的裂解测定。因此，其在缓解水华或抗菌应用中的潜在作用仍有待未来研究评估。蓝藻噬菌体中类孔蛋白的鉴定为未来探索基于噬菌体的疗法提供了宝贵的见解，特别是在抗生素耐药性问题日益严重的情况下，为传统抗生素提供了一种潜在的替代方案。未来的研究应侧重于ORF70在蓝藻宿主中的表达和功能分析，以及其在膜内的结构动力学及其与其他噬菌体蛋白（如内溶素）的相互作用。此外，孔蛋白活性在蓝藻噬菌体中的生态学意义，特别是其在自然环境中调节蓝藻种群的潜在作用，需要进一步研究。

4. 材料与方法

4.1. 序列分析

使用ExPASy Translate Tool预测ORF70的蛋白质序列。通过BLASTP（v2.8）比对NCBI nr数据库评估蛋白质相似性。使用ProtParam工具确定蛋白质特征，如分子量、氨基酸组成和理论等电点（pI）。使用SignalP 5.0鉴定信号肽。使用NOVOPRO预测二级结构。MaMV-DC中ORF70的GenBank登录号为AGR48635.1。

4.2. 细菌、蓝藻和蓝藻噬菌体培养

本研究中使用的细菌菌株和质粒列于表1。ORF70基因在大肠杆菌BL21（DE3）中表达，在37°C的LB（Luria-Bertani）肉汤或琼脂中培养。除非另有说明，在培养基中加入氨苄青霉素（100 μg/mL）。铜绿微囊藻FACHB-524按先前描述的方法培养，蓝藻噬菌体MaMV-DC使用该菌株作为宿主进行扩增。

4.3. 质粒构建

以蓝藻噬菌体MaMV-DC的基因组DNA为模板，使用特异性引物和高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。纯化含有ORF70的PCR产物，并使用一步克隆试剂盒将目标片段插入表达载体pET-21a（+）和pET-32a（+）中。将所得质粒导入感受态大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。此外，构建了融合质粒pET-32a-ORF70-GFP，以追踪ORF70在大肠杆菌中的细胞定位。

4.4. ORF70在大肠杆菌中的定位

将菌株（DE3: pET32a-ORF70-GFP和DE3: pET32a-GFP）在含有氨苄青霉素的LB肉汤中培养。当OD₆₀₀达到0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1 mM，并将温度调节至30°C。诱导4小时后，通过离心收集细胞，用PBS洗涤，并在荧光显微镜下观察。为了进一步确认ORF70在大肠杆菌中的定位，分离细胞组分进行Western blotting。使用大肠杆菌膜蛋白提取试剂盒提取膜组分。通过Western blotting分析全细胞、细胞质和膜组分。将蛋白质转移至PVDF膜上，用抗His标签单克隆抗体和HRP标记的山羊抗小鼠IgG检测。使用Pierce ECL Plus Western blotting底物显影。空pET32a质粒作为对照。

4.5. 细菌生长曲线测定

测量大肠杆菌的光密度（OD₆₀₀）以评估MaMV-DC的ORF70的影响。将过夜培养物按1:100稀释至新鲜培养基中，生长至OD₆₀₀为0.6。然后加入IPTG（1.0 mM），每30分钟读取一次OD₆₀₀。使用未加IPTG的菌株作为阴性对照，实验进行三次重复，每个处理三个重复。使用活/死荧光染料试剂盒测定细胞活力。IPTG诱导两小时后，按照制造商的方案对细胞进行染色。在荧光显微镜下拍摄每个样品的显微照片，使用N21（BP 515-560）滤光片观察绿色荧光，使用CY5-T（BP 635/10）滤光片观察红色荧光。使用ImageJ（2.x）从三个独立实验中量化死菌数量。通过比较死荧光阳性细胞数与活和死荧光阳性细胞总数来计算死细胞百分比。使用GraphPad Prism（8.0版）进行统计分析，并用适当的误差线绘制结果。

4.6. 能量毒素的毒素测定

大多数孔蛋白在存在某些能量毒素（如2,4-二硝基苯酚（DNP）或氰化钾）的情况下能够使细胞膜去极化，导致膜损伤和孔形成。因此，对DNP的敏感性是孔蛋白活性的关键指标。在本实验中，新鲜配制2 mL 1 mol/L DNP储备液。将转化了pET-21a-ORF70质粒的BL21（DE3）细胞（OD₆₀₀~0.5）用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导，并监测光密度（OD）。IPTG诱导25分钟后，加入DNP至终浓度为10 mmol/L（1:100稀释），阴性对照组省略DNP。在诱导后120分钟内连续记录培养物的OD。

4.7. β-半乳糖苷酶活性测定

为了评估膜完整性，将500 μL指定菌株的细胞外上清液与20 mM ONPG（O-硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷）混合，终体积为100 μL。将混合物在37°C下孵育1小时，然后加入0.5 mol/L Na₂CO₃终止反应。测量上清液的光密度（OD₄₂₀）以确定β-半乳糖苷酶活性。使用三个独立的生物学重复进行β-半乳糖苷酶测定，每个重复进行技术性三次重复。活性（U/mL）使用公式计算：（OD₄₂₀·V）/（T·V_S·0.0045），其中V是混合物的体积（mL），T是反应时间（分钟），V_S是用于测量OD₄₂₀的样品体积（mL），0.0045是消光系数（mL/nmol）。

4.8. 细菌形态学观察

通过离心收集细菌，然后用PBS（0.1 M）洗涤三次。使用革兰氏染色试剂盒进行革兰氏染色，并在光学显微镜下检查。对于透射电子显微镜（TEM）分析，将细菌用2.5%戊二醛固定，然后用0.1%四氧化锇染色1小时。然后将细菌通过一系列乙醇溶液（70%、80%、90%、95%和100% v/v）脱水，每个步骤在25°C下持续15分钟。将样品包埋在Epon 812中，切成超薄切片，并使用日立H-7650 TEM观察细菌形态变化。使用来自三个独立生物学重复的样品进行TEM观察，并对每个重复检查多个视野。

4.9. 统计分析

使用GraphPad Prism（8.0版）进行T检验。数据表示为至少三个独立实验的平均值±标准差，统计显著性考虑p值<0.05。

5. 结论

我们的研究为蓝藻噬菌体MaMV-DC中ORF70的类孔蛋白活性提供了证据。这项研究为噬菌体孔蛋白在抗菌治疗中的应用提供了潜在途径，并为噬菌体诱导细胞裂解的分子机制提供了见解。对孔蛋白功能的详细机制以及基于噬菌体的抗菌剂潜力的进一步研究可能有助于推进这一领域的发展。