《Foods》：Hybrid Genome Sequencing and Comparative Analysis of Three Novel Listeria monocytogenes Strains: Insights into Lineage Diversity, Virulence, Antibiotic Resistance, and Defense Systems
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本研究通过牛津纳米孔与Illumina混合测序技术，对三株新型单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）进行了高质量全基因组测序与比较分析。研究揭示了菌株间高度保守的核心基因组与多样化的附属基因组，并发现临床分离株A2D10携带LIPI-3毒力岛，提示其高毒力表型，为理解该食源性病原体的环境适应与致病机制提供了宝贵的基因组资源。
3.1. 新型L. monocytogenes全基因组的一般特征
本研究对三株新型单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）菌株进行了高质量的混合基因组测序与组装。其中，C5菌株分离自奶牛场环境，而A2D9和A2D10菌株则分离自临床病例，其中A2D10菌株与致命性临床结局相关。
通过CheckM2评估，所有三个组装体均显示出极佳的完整性（>99.9%）和极低的污染（<1%），GC含量为38%，与单核细胞增生李斯特菌的已知特征一致。进一步的基因组注释显示，菌株间基因组特征高度一致，预测基因数在2837至2971之间，其中蛋白质编码序列（CDS）在2769至2903之间。所有菌株均鉴定出67个tRNA基因和18个rRNA基因，表明RNA编码基因的核心基因组组织是保守的。此外，在所有菌株中均未鉴定到质粒。
3.2. 系统发育基因组学与全基因组比较分析
系统发育基因组学分析揭示了菌株间的进化关系。Mauve基因组比对表明，大多数基因组区域覆盖均匀。Circoletto分析直观地显示了菌株间的成对基因组比对，表明EGD-e与A2D9、C5与A2D10之间存在更近的亲缘关系。平均核苷酸一致性（ANI）矩阵结果证实了这一点，所有成对比较均超过98%，进一步确认了这些菌株对之间更紧密的关系。
3.3. L. monocytogenes菌株分型
通过BIGSdb-Lm进行初步分型预测，菌株C5和A2D10与血清群IVb关系最密切，而A2D9与血清群IIa关系最密切。JSpeciesWS分析显示，每个菌株的基因组都与特定环境来源的单核细胞增生李斯特菌具有高度相似性，表明这些菌株可能起源于乳制品环境。
进一步的多位点序列分型（MLST）分析显示，菌株C5被归为序列型（ST）2，属于克隆复合体（CC）2；菌株A2D9被归为ST155，属于CC155；菌株A2D10被归为ST1，属于高毒力CC1。核心基因组多位点序列分型（cgMLST）分析将菌株C5、A2D9和A2D10分别归为cgST9209、cgST21252和cgST32884，但由于数据库中存在多个几乎相同的cgMLST谱系，这些分配尚不明确。
3.4. 泛基因组与核心基因组分析
使用EDGAR 3.5进行的比较基因组学分析显示，这些基因组高度保守，核心基因组约占所有基因的80%，而仅有一小部分基因是单个分离株所特有的（附属基因组）。核心基因组与泛基因组的比较显示，随着更多菌株的加入，核心基因组保持相对稳定，仅略有下降，而泛基因组则持续增加，表明单核细胞增生李斯特菌作为一个物种具有不断进化和扩展的基因库。
维恩图显示，所有菌株共享2594个直系同源基因。菌株A2D10拥有48个独特基因，A2D9拥有47个，而菌株C5则含有93个其他分离株中不存在的基因。中间重叠部分反映了菌株子集中保守的基因，表明功能分化和可变的基因组含量。
3.5. 功能注释
功能分析显示，所有三个单核细胞增生李斯特菌菌株及参考菌株的蛋白质均被分配到相似的KEGG通路中。大多数基因与代谢功能相关，包括碳水化合物、氨基酸、能量、核苷酸和脂质代谢，以及遗传和环境信息处理及细胞过程。核心基因组和泛基因组的功能分布与单个菌株相似，而单例基因（singletons）的功能分布则显著不同。COG功能分类也观察到相似的模式。总体而言，KEGG和COG注释表明，主要的代谢途径和细胞过程在所有四个单核细胞增生李斯特菌菌株中基本保守，而单例基因的存在可能反映了菌株对特定环境生态位的特异性适应。
3.6. 毒力潜能
在所有单核细胞增生李斯特菌菌株中鉴定出40个毒力相关基因。某些基因在所有四个基因组中均被检测到，包括关键的致病性决定因子，如prfA、plcA、plcB、hly、actA和mpl，它们构成了单核细胞增生李斯特菌致病岛1（LIPI-1），对宿主细胞内的生存和扩散至关重要。基因组还携带多个内化素基因（inlA, inlB, inlC, inlF, inlK），介导粘附、侵袭和免疫逃逸，以及表面粘附素vip基因。此外，编码核靶向蛋白的lntA基因以及oatA、bsh、prsA2、iap、lap、lapB和fbpA等参与宿主相互作用和定植的毒力因子也存在于所有菌株中。
菌株A2D9和EGD-e均携带额外的内化素基因inlJ，以及pdgA、aut和ami基因，表明其表面和细胞壁相关致病性特征的扩展库，可能增强其粘附、侵袭和在宿主体内持续存在的能力。
菌株A2D10的基因组还含有完整的lls基因簇（llsA, llsB, llsD, llsG, llsH, llsP, llsX, llsY），形成了单核细胞增生李斯特菌致病岛3（LIPI-3），编码硫唑/恶唑修饰的微菌素李斯特菌溶素S（LLS）。该肽由高毒力单核细胞增生李斯特菌菌株产生，与严重的李斯特菌病暴发相关，并能修饰宿主肠道微生物群，促进有效的肠道定植和内部器官的侵袭。这些发现与该菌株的致命性临床结局一致。菌株C5与其他菌株相比，未携带任何独特的毒力基因。
3.7. 抗菌药物耐药性
所有单核细胞增生李斯特菌菌株的体外抗菌药物测试显示出相同的敏感性谱。所有分离株对头孢西丁、苯唑西林、达托霉素和莫西沙星耐药，对环丙沙星呈中度敏感，对氨苄西林、苄青霉素、庆大霉素、红霉素、克林霉素、奎奴普丁/达福普汀、利奈唑胺、替考拉宁、万古霉素、替加环素和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑敏感。
基因组筛选揭示了内在耐药基因fosX、norB、mprF和lin的存在。这些基因分别赋予对磷霉素、氟喹诺酮类、阳离子抗菌肽和林可酰胺类的耐药性。fosX、norB和mprF的存在与观察到的对β-内酰胺类、达托霉素和氟喹诺酮类的耐药性一致。此外，所有菌株均携带mdrL基因，该基因编码一种多药外排泵，负责输出大环内酯类、头孢噻肟、重金属、溴化乙锭和苯扎氯铵。mdrL、fosX、norB、mprF和lin的联合存在突显了单核细胞增生李斯特菌菌株保守的多药耐药谱，支持了体外抗菌药物测试的结果。
3.8. 防御机制及其他特征
在所有单核细胞增生李斯特菌菌株中鉴定出多种防御机制。菌株C5拥有I型、II型和IIG型限制修饰（R-M）系统。菌株A2D9携带CRISPR-Cas IB型系统，以及一个由ATP酶和蛋白酶组分组成的Iet系统，还有一个retron I-C防御模块。菌株A2D10预测具有II型R-M系统，以及一个通过tRNA切割发挥功能的RloC蛋白。此外，该菌株还含有流产感染系统（Abi）和防御相关逆转录酶（DRT）系统。EGD-e菌株也预测具有R-M II型和Abi防御系统。
所有菌株均含有一个可疑和一个不完整的原噬菌体区域，但EGD-e除外，它含有两个可疑区域。此外，菌株C5含有一个完整的原噬菌体区域。菌株C5、A2D9和EGD-e各携带四个基因组岛，而菌株A2D10携带两个。防御系统、原噬菌体区域和基因组岛的差异突显了单核细胞增生李斯特菌菌株的基因组可塑性及其通过水平基因转移进行的持续适应。
