新型N-糖苷酶（EndoBI-2）的探索：从重组生产到释放生物活性N-糖链

《International Journal of Molecular Sciences》：Exploring the Activity of a Novel N-Glycosidase (EndoBI-2): Recombinant Production to Release Bioactive Glycans

本综述聚焦于一种新型内切-β-N-乙酰葡萄糖胺酶（EndoBI-2）的重组生产、表征及其在释放生物活性N-糖链（N-glycans）中的应用。该酶源自婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium longum subsp. infantis），能在温和条件下（如pH 5）高效切割糖蛋白核心壳二糖（chitobiose）结构，释放包括高甘露糖型（HM）和复杂型在内的多种N-糖链，克服了传统化学法（如肼解）和酶法（如PNGase F）的局限性。其广泛的底物特异性、温度耐受性（24–37 °C）及对天然糖蛋白的活性，使其成为糖生物技术中一种有前景的工具，为功能性糖链的大规模制备和应用奠定了基础。

　　

Abstract

肠道微生物组随宿主发育、健康状态、生活方式、营养和微生物相互作用而演变。肠道微生物群的生存依赖于其利用宿主难以消化的复杂寡糖的能力。某些肠道微生物产生糖苷酶，可切割N-糖蛋白以释放N-糖链，随后将其作为碳源利用。然而，商业糖苷酶效率低下，因此需要改进去糖基化策略以研究其功能并扩大生产规模。因此，本研究的主要目的是重组生产并表征来自婴儿双歧杆菌（B. infantis）的新型内切-β-N-乙酰葡萄糖胺酶2（EndoBI-2），并评估其用于可控释放N-糖链的酶学性能。此外，使用模型糖蛋白RNase B研究了EndoBI-2的最佳反应条件。通过亲水相互作用液相色谱-荧光检测-四极杆飞行时间串联质谱（HILIC-FLD-QTOF-MS/MS）对释放的N-糖链进行了分析。研究证明，EndoBI-2具有很强的温度耐受性，并在温和反应条件下有效切割N-糖链，在pH 5时表现出高活性。这些发现凸显了EndoBI-2作为一种稳健高效的生物催化剂，可用于从多种N-糖蛋白生产具有生物活性的N-糖链，在糖生物技术中具有潜在应用价值。

1. Introduction

人类肠道微生物群（HGM）是一个动态生态系统。HGM的稳定性和功能性取决于特定微生物利用复杂的、宿主来源的、人类难以消化的糖链的能力。附着在糖蛋白上的N-糖链在细胞通讯、免疫调节和代谢中扮演着关键的生物学角色。哺乳动物乳蛋白的糖基化是一种普遍且重要的翻译后修饰，影响其折叠、结构稳定性、靶向性及其最终的生物学功能。与蛋白质共价连接的寡糖被称为糖链，其结构极其多样。这些糖链可以通过N-糖苷键或O-糖苷键与蛋白质连接。N-连接糖链（N-糖链）通过N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）与天冬酰胺（Asn）残基的酰胺基团连接，连接序列为Asn-X-Ser/Thr或Asn-X-Cys（其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸）。基本上，N-糖链核心由两个N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和三个甘露糖（Man）残基组成。根据其组成，额外的糖基化将N-糖链分为三种主要类型：高甘露糖型（HM）、杂合型和复杂型。HM糖链通常有五个到九个主要残基连接到壳二糖（GlcNAc₂）核心，并带有未取代的末端甘露糖。杂合型糖链的特征是部分甘露糖残基被GlcNAc单元取代。复杂型糖链含有GlcNAc残基。糖链功能的多样性取决于其结构的多样性，包括组成单糖的组合和分支模式的变化。

在糖生物学中，传统化学方法常用于糖蛋白的去糖基化。两种最流行的方法是肼解和β-消除。用于糖链研究的化学方法存在许多缺点。碱性条件和还原性化学物质（如硼氢化钠）可能对糖链产生不利影响。还原剂将标记基团转化为醛糖醇，使荧光团或发色团的附着复杂化。监测去糖基化过程很困难，并且高盐度可能导致显著的样品损失。肼处理是一种化学去糖基化方法，能够从糖蛋白中释放N-糖链，但需要苛刻的反应条件，可能损害蛋白质完整性。通过调整反应参数（如温度），该方法可以在受控条件下释放N-糖链。

肽-N-糖苷酶（PNGases）等酶在N-乙酰葡萄糖胺与岩藻糖结合时无法切割糖链。PNGase活性需要严苛条件，如变性，这可能损害释放的糖链和剩余多肽结构的完整性。内切糖苷酶，如F1、F2和F3，对天然糖蛋白表现出增强的活性，但对多天线复杂N-糖链的活性有限。像Endo F1-F3这样的内切糖苷酶对多天线复杂N-糖链的有限活性主要归因于结构复杂性的增加和空间位阻。虽然HM和杂合型N-糖链具有分支较少、壳二糖核心更易接近的结构，但复杂型N-糖链通常包含多个天线、平分型GlcNAc残基和核心岩藻糖基化，这些都会阻碍酶的结合和催化效率。Karav等人（2015年）证明，来自婴儿双歧杆菌（B. infantis）ATCC 15697（一种关键的婴儿肠道微生物）的EndoBI-1能够切割存在于所有类别N-糖链核心中的N-N′-二乙酰壳二糖键。因此，需要具有更广泛底物特异性和更高稳定性的新型内切-β-N-乙酰葡萄糖胺酶。

本研究重组生产并表征了一种新型酶——内切-β-N-乙酰葡萄糖胺酶2（EndoBI-2）。与传统的化学和酶学方法相比，该酶对糖蛋白具有高活性，并能释放不同类型的N-糖链，包括HM型和复杂型。尽管N-糖链作为生物活性分子在营养和生物技术中具有潜在应用价值已得到认可，但用于从天然糖蛋白中高效、选择性释放N-糖链的酶学工具仍然有限。EndoBI-2的这一独特特性为从乳过氧化物酶（LPO）等糖蛋白生成N-糖链提供了一种潜在有用的方法。

基于这些考虑，研究假设EndoBI-2具有有效的底物特异性，能够在温和反应条件下高效释放与模型和天然糖蛋白结构不同的N-糖链类型。因此，本研究的主要目的是评估EndoBI-2的重组生产、酶活性和去糖基化能力，从而满足对可控释放N-糖链的稳健酶学平台的需求。

2. Results

2.1. Recombinantly Produced Enzyme EndoBI-2 Shows Activity on Model Glycoprotein RNase B

EndoBI-2酶通过体内克隆系统成功克隆。在之前的计算机模拟研究中，对EndoBI-2进行了全面的结构研究以确定其保守结构域和功能区域。为了增强重组酶在异源宿主中的溶解度和功能性表达，在克隆过程中去除了跨膜区和信号肽区域。使用模型糖蛋白核糖核酸酶B（RNase B）证明了重组EndoBI-2的活性。RNase B是一个17 kDa的N-糖基化蛋白，去糖基化后产生一个14–15 kDa的蛋白。

2.2. Optimizing EndoBI-2 Enzymatic Activity

EndoBI-2在较宽的温度范围（24–37 °C）内有效运作。该酶在37 °C时表现出最高活性，并在24 °C和30 °C下保持稳定，表明具有良好的热耐受性。然而，pH变化对EndoBI-2活性的影响很小，其在pH 5时保持最佳性能。数据显示，EndoBI-2在三种测试温度下均在pH 5保持其活性。当温度保持在37 °C时，该酶在pH 5、pH 6和pH 7下均对RNase B起作用，甚至在pH 5时仍保持高活性。

2.3. Profiling of N-Glycans Released from RNase B and LPO by EndoBI-2 Deglycosylase

在优化了酶反应参数（包括pH和温度）后，使用广泛认可的模型N-糖蛋白RNase B和天然N-糖基化蛋白LPO评估了EndoBI-2的去糖基化能力。已知RNase B仅携带HM型N-糖链，研究有兴趣检验EndoBI-2是否能释放连接到LPO的复杂型、末端唾液酸化的N-糖链。图A显示了从RNase B释放的HM型N-糖链的FLD色谱图，以及它们的质谱图B和C。在EndoBI-2酶处理后，通过LC-MS/MS分析了释放的糖链，该酶特异性切割N-糖链同时保留还原端。图A说明了LPO糖蛋白的N-糖链分析结果。研究揭示LPO含有一个异质性的N-糖链群体，包括HM型和复杂型N-糖链。如图A所示，检测到的N-糖链的组成基于其精确质量和在HILIC柱上的特征保留时间得到确认。洗脱顺序反映了亲水性的增加，这与分子量的增加重叠，唾液酸化的N-糖链显示出更长的保留时间。图B-D中呈现的MS/MS谱图验证了提出的N-糖链结构，显示了由糖苷键主要断裂产生的诊断性碎片离子，以及跨环断裂。这些断裂模式使得能够精确区分分支和唾液酸化等结构特征。

3. Discussion

3.1. Biological Relevance of EndoBI-2 in N-Glycan Utilization

本研究的主要目的是分析EndoBI-2的酶学性能，并检验其在温和反应条件下从模型和天然糖蛋白释放结构多样的N-糖链的潜力。与本研究获得的实验结果一致，下面的讨论侧重于将这些发现置于相关的生物学和功能背景中。母乳喂养影响新生儿生命最初几个月的肠道微生物群组成，因为大量的人乳寡糖（HMOs）作为碳源供多种细菌（如双歧杆菌属）利用，这些细菌已进化出代谢这些寡糖的分子机制。细菌内切-β-N-乙酰葡萄糖胺酶（EC 3.2.1.96）在从糖蛋白释放N-糖链中起着核心作用，使某些肠道微生物能够利用这些复杂碳水化合物作为碳源。该酶组的成员已在婴儿双歧杆菌（B. infantis）、长双歧杆菌（B. longum）和短双歧杆菌（B. breve）中发现，它们是婴儿肠道微生物群的关键居民，有助于消化乳源糖复合物。在第2节中观察到的EndoBI-2酶活性与内切-β-N-乙酰葡萄糖胺酶在促进从糖蛋白底物获取N-糖链方面的生物学作用一致，从而支持了适应糖链的微生物中的糖链利用途径。

3.2. Substrate Specificity and Catalytic Properties of EndoBI-2

在这些酶中，EndoBI-2代表了GH18家族的一个独特成员，具有独特的结构和功能特性。与先前表征的内切糖苷酶不同，EndoBI-2表现出广泛的底物特异性，并在温和的酸性条件下有效运作，无需变性。由于这一特性，EndoBI-2与传统的去糖基化酶（包括通常需要严苛反应条件且对天然糖蛋白活性有限的PNGase F）区分开来。另一方面，EndoBI-2拥有这一特性。这些特性使EndoBI-2成为一种有价值的生物催化剂，用于从天然糖蛋白中选择性释放具有生物活性的N-糖链。如本研究呈现的去糖基化结果所示，EndoBI-2有效作用于天然糖蛋白的能力支持了其广泛的底物特异性，并在功能上将其与传统的去糖基化酶区分开来。这种功能行为为观察到的在温和反应条件下释放结构多样的N-糖链提供了机制基础。

3.3. Deglycosylation Performance on Model and Native Glycoproteins

在本研究中，重组生产并表征了一种新型酶EndoBI-2。与传统的化学和酶学方法相比，该酶对糖蛋白具有高活性，并释放不同类型的N-糖链，包括HM和复杂结构。除了确认酶的催化效果在结构多样的糖蛋白中得以维持外，RNase B和LPO的成功去糖基化证明了该酶广泛的底物耐受性。这种独特的催化能力突出了其作为从LPO和乳铁蛋白等多种糖蛋白产生具有生物活性的N-糖链的有效生物催化剂的潜力。第2节中呈现的RNase B和LPO的去糖基化结果提供了直接的实验证据，支持了EndoBI-2在所应用的反应条件下具有广泛的底物耐受性。此外，优化了EndoBI-2的酶学参数和反应条件，并使用HILIC-FLD-QTOF-MS/MS对释放的糖链进行了分析，从而能够进行详细的结构确认并与先前报道的N-糖链谱进行比较。这种分析方法能够系统评估EndoBI-2释放的糖链结构，并促进与已建立的N-糖链数据集的直接比较，从而加强了对实验结果的解释。

图A中的HILIC谱图表明EndoBI-2能有效切割RNase B的HM N-糖链。在HILIC数据中，相同的HM前体出现在多个紧密相邻的保留时间，表明存在色谱上不同的物种。尽管这些形式显示出几乎相同的MS/MS断裂模式，但它们不同的HILIC保留支持了结构异构体的存在。研究结果与Prien等人（2008年）报道的N-糖链谱一致，他们鉴定出Man₅GlcNAc₂、Man₇GlcNAc₂和Man₈GlcNAc₂是RNase B的主要N-糖链。正如预期，本研究中使用EndoBI-2导致释放了Man₅-Man₈GlcNAc结构（而非Man₅-Man₈GlcNAc₂），这是由于在两个核心GlcNAc残基之间进行了切割。此外，HILIC和MS/MS数据揭示了HM糖链的多种异构形式，这进一步支持了先前描述的RNase的结构异质性。

另一方面，研究结果表明EndoBI-2在温和反应条件下能有效从天然LPO中释放去唾液酸化和唾液酸化的N-糖链，从而证实了其相对广泛的底物特异性。总体而言，结合使用EndoBI-2消化和LC-MS/MS能够可靠地检测和表征从LPO释放的N-糖链的组成。这些观察结果与Wolf等人（2000年）报道的详细N-糖链表征一致，他们证明牛LPO主要携带HM型和复杂型糖链，其中几种在我们的分析中也检测到。尽管Wolf等人报道了核心岩藻糖基化结构，但此处未观察到此类物种，因为EndoBI-2在核心壳二糖内切割并移除了最内侧的GlcNAc–Fuc部分，从而阻止了在释放的糖链库中检测到核心岩藻糖。然而，这一特性在需要选择性切割核心岩藻糖基化N-糖链同时保留天线岩藻糖基化以