《Viruses》：Development of an Ultrasensitive ELISA Assay for Evaluating HIV-1 Envelope Glycoprotein as a Marker for Targeted Activator of Cell Kill
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本推荐语概括了开发一种新型超灵敏酶联免疫吸附测定（ELISA）方法的研究。该方法用于定量人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）包膜糖蛋白（gp120），其检测灵敏度（LLOQ为0.16 pM）可与单分子阵列（Simoa）平台相媲美，但成本更低。研究通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）验证了特异性，并在细胞模型（如2D10和MOLT IIIB）及靶向细胞杀伤激活剂（TACK）化合物处理的原代CD4+T细胞中进行了药理学验证。该测定法为评估靶向HIV-1感染细胞的治疗策略（如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和嵌合抗原受体T细胞（CAR-T））的疗效提供了可靠的生物标志物检测工具，在HIV-1治愈研究中具有应用潜力。
开发与表征gp120测定法
研究通过比较使用不同捕获和检测试剂的夹心ELISA，开发了一种用于定量HIV-1 gp120蛋白的免疫测定法。初步实验评估了使用gp120天然配体可溶性CD4（sCD4）蛋白与抗gp120抗体作为检测试剂的效能。结果显示，碱性磷酸酶（AP）标记的抗gp120抗体VRC07在检测包被的gp120或gp160蛋白时，产生的信号强于使用生物素标记的sCD4蛋白和链霉亲和素-AP的组合。随后，在确定最佳捕获试剂时，比较了包被sCD4蛋白与抗gp120抗体2G12的效果，并使用VRC07-AP进行检测。结果表明，使用2G12抗体捕获gp120蛋白或MOLT IIIB细胞裂解液时，信号均高于sCD4捕获。基于这些结果，研究选择使用两种抗gp120抗体的夹心免疫测定法进行gp120测量。
为了筛选最佳的抗gp120结合抗体，研究进行了间接ELISA，测试了10种不同的抗gp120抗体。其中7种抗体呈现阳性信号，2G12产生的信号最高，其次是VRC07、Sigma抗gp120多克隆抗体SAB3500463和447-52D。最后，通过测试不同捕获抗体和检测抗体的组合，确定了最佳抗体对。使用MOLT IIIB细胞裂解液作为gp120抗原来源，测试了三种AP标记的检测抗体（2G12-AP, VRC07-AP, 447-52D-AP）与四种捕获抗体（VRC07, 2G12, PG9, Sigma SAB3500463）的组合。结果显示，使用VRC07作为捕获抗体、2G12-AP作为检测抗体的组合产生了最高的信噪比（S/B），因此被选用于后续的测定法开发和优化。
对测定法的特性进行了进一步评估。重组gp120蛋白的标准曲线在七个连续稀释度（10 pM至0）范围内呈线性（R2 = 0.9999）。根据变异系数（%CV）小于20%的标准，测定法的定量下限（LLOQ）确定为0.16 pM。该测定法在检测系列稀释的MOLT IIIB细胞裂解液中的gp120时也表现出线性。特异性通过竞争抑制实验确认：加入100倍过量的未标记VRC07或2G12抗体可使信号降低90%以上，而加入100倍过量的人IgG（hIgG）则信号不变；以牛血清白蛋白（BSA）替代裂解液的阴性对照孔中未检测到信号。此外，测定法对HIV病毒株A、B和C群的代表毒株均表现出广泛的反应性。总之，所开发的gp120 ELISA具有高灵敏度、高特异性和广泛的反应性，适用于亚皮摩尔（pM）水平的gp120检测。
Simoa和AP-ELISA平台用于gp120测量的比较
为了使用选定的2G12和VRC07抗体对开发更灵敏的gp120定量方法，研究评估了超灵敏数字免疫测定平台——单分子阵列（Simoa），并将其与新开发的AP-ELISA进行了比较。Simoa平台对重组gp120在50 pM至0的浓度范围内表现出线性信号检测，其LLOQ达到0.23 pM。Simoa成功在相当于每个 assay 反应含500个细胞的MOLT IIIB细胞裂解液样本中检测到gp120。信号随着MOLT IIIB细胞裂解液的2倍系列稀释而线性下降，检测限约为每个反应31个细胞，此时变异系数（CV）为18.3%。
同时，使用AP-ELISA平台测量了相同MOLT IIIB细胞裂解液中的gp120。在每反应500个细胞的浓度下获得的信号，经系列稀释至每反应16个细胞时呈线性下降。AP-ELISA对gp120的检测限同样确定为每反应31个细胞，CV为9.6%，与Simoa平台观察到的LLOQ一致。在相同细胞浓度下，Simoa和AP-ELISA测得的gp120数值呈正相关，相关系数（R2）为0.997。综上所述，所开发的AP-ELISA表现出与Simoa平台相当的检测限，证实了其使用相同抗gp120抗体对进行gp120定量的灵敏度和可靠性。
gp120免疫沉淀与LC-MS分析
为了进一步评估测定法的特异性和灵敏度，研究使用抗gp120抗体VRC07对重组gp120蛋白（作为对照）和MOLT IIIB细胞裂解液进行了免疫沉淀（IP），随后进行了液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析。重组gp120经胰蛋白酶消化后获得一个gp120肽段（氨基酸Ile496至Lys505，序列为IEPLGVAPTK），作为gp120蛋白定量的替代肽。合成了该肽段的"重"同位素标记版本，并以恒定浓度（1 nM）加入每个IP样本中，作为计算用的内参标准。将代表替代肽（Ile496-Lys505）的LC-MS多反应监测（MRM）峰面积与重标记参考肽的峰面积之比作为测定读数。
结果显示，计算得到的替代肽与重标记参考肽的比值随着含有50,000个、5,000个和500个细胞的MOLT IIIB细胞裂解液的10倍系列稀释而线性下降。在这些稀释度下，比值分别为0.898、0.103和0.028。在500个细胞与50个细胞之间未观察到比值的显著变化，表明低于500个细胞时定量准确性丧失。这些结果证实了被VRC07免疫沉淀的蛋白是HIV-1 gp120，并且IP-LC-MS测定法能够检测HIV gp120，其定量限估计为每样本500个细胞（CV = 15.9%）。与Simoa和AP-ELISA平台相比，LC-MS/MRM可达到的LLOQ大约高出10倍，因此，鉴于其高通量能力、灵敏度、特异性和易用性，选择AP-ELISA平台用于后续研究。
使用2D10细胞系验证gp120 ELISA
研究使用可在刺激后表达gp120的2D10细胞系对基于AP-ELISA平台开发的gp120 ELISA进行了验证。结果显示，在未刺激的2D10细胞中，与BSA阴性对照相比，未检测到显著的gp120。然而，在用100 ng/mL PMA和1 μg/mL离子霉素或5 ng/mL肿瘤坏死因子α（TNFα）刺激24小时后，观察到强烈的gp120表达；用0.5 μM组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）伏立诺他（VOR）处理后检测到的表达较弱。gp120诱导量的排序为：PMA/离子霉素 > TNFα > HDACi VOR。基于这些结果，选择PMA/离子霉素用于进一步评估gp120表达的时程和剂量反应实验。
时程研究显示，与刺激前水平相比，gp120表达在处理后12小时变得显著。gp120表达峰值在诱导后16小时达到，并在24小时内保持稳定。在剂量反应研究中，评估了PMA/离子霉素处理24小时后的gp120表达。2D10细胞裂解液中的gp120水平在PMA浓度从0.02 ng/mL到20 ng/mL的范围内显著增加，表现出剂量依赖性反应。计算得出PMA的半数有效浓度（EC50）为0.52 ng/mL。研究还使用流式细胞术监测了PMA/离子霉素处理细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达，同时使用ELISA平台定量gp120。结果显示，GFP表达与gp120水平高度相关，相关系数（R2）为0.992。这些结果共同证实，所开发的gp120 ELISA能够可靠地测量2D10细胞裂解液中经PMA/离子霉素及其他激动剂刺激后的gp120表达。
在经抗逆转录病毒药物处理的HIV感染CD4+T细胞中测量gp120
为了确定gp120蛋白测定法是否可以作为消除HIV-1感染细胞的替代生物标志物，研究测量了经100 nM TACK分子处理72小时的体外HIV-1感染的人CD4+T细胞裂解液中的gp120水平。在对照DMSO处理组中检测到了gp120。在TACK处理组中，观察到gp120水平显著降低，与DMSO组相比，细胞相关gp120减少了56%。在TACK与HIV蛋白酶抑制剂茚地那韦（IDV）联合处理组中，IDV对HIV-1蛋白酶的抑制阻断了TACK的杀伤效应，未检测到gp120水平的显著变化。同样，在仅用非TACK分子处理或非TACK与IDV联合处理的细胞中，gp120水平保持不变。
同时，在相同样本的裂解液中测量了HIV-1 p24蛋白水平。p24水平的变化与gp120的变化一致。仅在TACK处理组中观察到p24浓度显著降低，而在TACK与IDV共处理、非TACK或非TACK与IDV共处理组中均未检测到显著变化。裂解液中gp120与p24蛋白水平呈正相关，相关系数（R2）为0.989。此外，使用定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）靶向HIV-1 gag区域定量了细胞相关的HIV-1 RNA水平。与DMSO处理组相比，TACK处理显著降低了病毒RNA水平。这种效应在加入IDV后完全被阻断，而在非TACK或非TACK与IDV共处理组中未观察到病毒RNA水平的显著变化。gp120水平与HIV-1 RNA水平之间的相关系数（R2）为0.773。
为了评估TACK处理导致的HIV-1阳性细胞数量的减少，研究开发了gp120免疫细胞化学（ICC）方法，使用抗gp120单克隆抗体对gp120阳性细胞进行染色。在DMSO处理组中，约有8%的CD4+T细胞为gp120阳性，反映了本研究中使用的体外HIV-1感染模型的感染率约为8%。经TACK处理后，gp120阳性细胞的百分比显著下降至约3%。这种减少在加入IDV后完全被阻断，导致gp120阳性细胞数量无显著变化。同样，在非TACK或非TACK与IDV共处理组中未观察到主要变化，gp120阳性细胞的百分比分别为8.3%和8.5%。总之，与HIV-1 p24蛋白类似，HIV-1 gp120可以作为可靠的替代生物标志物，用于评估TACK分子在细胞实验中对HIV-1感染CD4+T细胞的杀伤效力。
讨论与结论
本研究成功开发并验证了一种新型、灵敏、特异且成本低廉的夹心ELISA，用于定量HIV-1包膜糖蛋白gp120。该测定法使用一对结合gp120不同区域的单克隆抗体（VRC07和2G12），对A、B、C三种主要HIV-1病毒株的代表毒株均具有广泛的敏感性。其检测灵敏度（LLOQ为0.16 pM）与超灵敏的Simoa数字ELISA平台相当，但成本更低且无需特殊仪器。测定法的特异性通过IP-LC-MS得到确认，并在2D10可诱导细胞系和基于TACK作用机制的HIV-1感染细胞杀伤实验中得到药理学验证。
尽管联合抗逆转录病毒治疗（cART）已成功将HIV-1转变为一种慢性可控疾病，但cART无法根除HIV-1储存库，停药后病毒会反弹。因此，寻找新的生物标志物来量化治疗中断前的病毒储存库至关重要。gp120作为存在于感染细胞表面的关键蛋白，是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）等治疗策略的重要靶点。本研究证明，在TACK处理后，感染细胞裂解液中的gp120水平显著降低，且与p24蛋白和病毒RNA水平具有良好的相关性，支持其作为评估靶向感染细胞治疗效力的生物标志物的潜力。
所开发的AP-ELISA平台为测量HIV-1感染细胞中的gp120提供了一种有价值的技术工具，在HIV-1治愈研究中具有进一步应用的前景。未来的研究需要在来自HIV感染者（PWH）的原代细胞中，特别是在经潜伏逆转剂（LRA）处理后，进一步验证gp120作为生物标志物的效用。
