《Cancers》：Synthesis and Biological Evaluation of a Caffeic Acid Phenethyl Ester Derivatives as Anti-Hepatocellular Carcinoma Agents via Inhibition of Mitochondrial Respiration and Disruption of Cellular Metabolism
编辑推荐：
本文推荐了一篇关于咖啡酸苯乙酯（CAPE）衍生物WX006抗肝癌作用机制的研究。该研究通过多组学技术（转录组学、代谢组学）结合分子模拟（分子对接、分子动力学），首次揭示WX006通过靶向线粒体复合物I亚基NDUFS2，诱导NAD+耗竭及铁/铜离子稳态失衡，协同触发铁死亡（ferroptosis）和铜死亡（cuproptosis）。其在动物模型（异种移植瘤、原位瘤）中展现出优于索拉非尼（sorafenib）的抑瘤效果及良好安全性，为基于天然产物的抗肝癌药物研发提供了新策略。
3.1.1. Synthesis of Compounds
研究团队设计并合成了28个咖啡酸苯乙酯（CAPE）衍生物，并评估了它们对两种代表性人肝癌细胞系（Huh7和Hep3B）的抗增殖活性。其中，化合物WX006（二苯乙基 3,3′-(4,5-二羟基-1,2-亚苯基) (2E,2′E)-二丙烯酸酯）显示出最强的抗增殖效果，其48小时后的半抑制浓度（IC50）值分别为3.332 μM和3.764 μM，显著低于母体化合物CAPE。因此，WX006被选作后续抗肿瘤功效和潜在机制研究的候选化合物。
3.2.1. Evaluation of the Cytotoxic Activity of the Selected Compounds
基于IC50值，研究团队初步总结了该系列CAPE衍生物的构效关系（SAR）。关键发现包括：α,β-不饱和共轭双键是活性所必需的；保留游离的儿茶酚结构对抗增殖效力至关重要；酯键作为核心连接，其立体化学显著调节活性，例如在酯氧的α位引入甲基会产生显著的立体化学效应，R构型的活性明显优于S构型；对苯环的修饰（无论是给电子基团还是吸电子基团）并未显著增强抗增殖活性；在侧链优化方面，将烷基长度延长至C4可增强活性，但进一步延长（如至C5）会导致活性下降。最具影响力的策略是构建双侧链结构，其赋予的活性显著优于单侧链CAPE衍生物。WX006的高效力印证了这些SAR见解。
3.2.2. WX006 Suppresses HCC Cell Growth via Non-Apoptotic Mechanisms and Induces Ferroptosis Coupled with Cuproptosis, Effectively Impairing DNA Replication in HCC Cells
WX006在多种HCC细胞系中表现出良好的生长抑制率，且对小鼠肝原代细胞毒性较低，表明其对肿瘤细胞具有靶向抑制作用。克隆形成实验和划痕实验表明WX006能有效抑制HCC细胞的集落形成和迁移。流式细胞术分析显示WX006处理导致G1/S期阻滞，但并未显著增加细胞凋亡。EdU实验和DNA纤维分析表明WX006通过诱导复制应激，阻碍DNA合成，从而减缓细胞分裂。通过使用针对不同细胞死亡途径的药理学抑制剂，研究发现铜死亡抑制剂 ammonium tetrathiomolybdate (ATTM) 和铁死亡特异性抑制剂 Ferrostatin-1 (Fer-1) 均能显著逆转WX006对HCC细胞的细胞毒性作用，表明WX006的抗肿瘤功效主要通过诱导铁死亡和铜死亡介导。
3.2.3. Transcriptome Sequencing Revealed That WX006 Induces UPR and ISR in HCC Cells
对WX006处理前后的两种HCC细胞系进行高通量RNA测序（RNA-seq）分析，揭示了显著的转录组改变。基因集富集分析（GSEA）显示，在Hep3B细胞中，WX006主要富集于葡萄糖饥饿反应、内质网未折叠蛋白反应（UPR）、细胞能量稳态、内质网应激诱导的内在凋亡等通路；而在Huh7细胞中，则主要富集于线粒体膜破坏、E2F靶基因、G2/M检查点调控、糖酵解、缺氧反应等通路。KEGG通路富集分析显示，在两种细胞模型中均观察到细胞周期蛋白家族基因转录水平的一致下调，以及内质网蛋白加工通路中PERK-ATF4-CHOP信号轴的显著激活。这些发现支持了WX006通过诱导内质网功能障碍破坏细胞内蛋白质稳态，从而发挥抗肿瘤功效的模型。
3.2.4. WX006 Activates ER Stress and UPR Through p-eIF2α-ATF4 Signaling
药理学干预实验表明，钙通道阻滞剂2-AD、细胞内钙螯合剂BAPTA-AM和内质网应激抑制剂4-PBA能显著减弱WX006的细胞毒性，而PERK抑制剂ISRIB则不能挽救细胞活力。RT-qPCR分析证实WX006显著上调了内质网应激和钙离子稳态相关基因的表达。钙离子染色显示WX006处理显著增加了细胞内钙水平，且该升高可被IP3受体抑制剂2-AD逆转。转录组学和靶向质谱分析表明WX006重编程了氨基酸代谢网络，触发营养应激和氧化还原失衡。补充S-腺苷甲硫氨酸（SAM）或甲硫氨酸（Met）能有效减轻WX006诱导的细胞死亡。
3.2.5. WX006 Depletes Intracellular NAD+and NADP+as Well as Disrupts One-Carbon Metabolism
非靶向代谢组学分析显示，WX006处理后，Huh7细胞中5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-CH2-THF）显著积累，表明一碳代谢下游过程受损。通路富集分析揭示了精氨酸/脯氨酸代谢、核心肿瘤碳代谢、mTOR信号传导等方面的显著扰动。定量分析显示WX006处理1-12小时内，两种细胞系的NADP+水平耗竭，NADP+/NADPH比率降低，同时NAD+/NADH比率也降低。靶向代谢组学证实了糖酵解和三羧酸循环中间体的抑制，与ATP耗竭相关。挽救实验表明NAD+（而非NADP+）补充能减弱WX006诱导的细胞死亡，表明NAD+耗竭在介导细胞毒性中起关键作用。
3.2.6. WX006 Induces Ferroptosis and Cuproptosis in HCC Cells
RT-qPCR分析显示WX006处理后铁死亡相关基因表达升高。外源性亚铁离子补充显著减弱了细胞死亡，而铁螯合剂deferoxamine mesylate (DFOM) 则没有缓解作用。谷胱甘肽代谢分析显示GSH和GSSG池均进行性耗竭，GSH/GSSG比率降低。定量比色法和FerroOrange荧光成像显示处理后细胞内亚铁离子显著积累。丙二醛（MDA）量化揭示了显著的脂质过氧化。透射电镜显示了线粒体空泡化和内质网扩张等超微结构损伤。JC-1染色证实了线粒体膜电位崩溃和ATP耗竭。铜定量分析显示时间依赖性的细胞内铜积累。免疫荧光检测到剂量依赖性的DLAT寡聚化。
3.2.7. WX006 Disrupts Cellular Metal Homeostasis and NAD+Metabolism in HCC Cells
紫外光谱表征显示WX006在体外具有剂量依赖性的亚铁离子螯合能力。WX006处理显著抑制了从Huh7和Hep3B细胞分离的线粒体中所有呼吸链复合物的活性。亚铁离子补充和ATTM共同处理有效恢复了复合物I/II的功能性，而NAD+补充显示出部分恢复。复合物III/IV的活性则不可逆地受损。ATP定量表明亚铁离子补充显著恢复了细胞ATP水平。NAD+代谢组合处理分析表明，烟酸/烟酰胺补充能有效重建NAD+稳态，提示WX006诱导的NAD+耗竭源于过度消耗而非生物合成途径抑制。
3.2.8. WX006 Disrupts HCC Cellular Metabolism Through Binding to the NDUFS2 Site
分子对接研究确定了WX006与复合物I（NDUFS2-NDUFS7-ND1, PDB:6ZTQ）的CoQ10结合口袋之间存在高亲和力相互作用。分子动力学（MD）模拟证实了复合物的结构稳定性。药物亲和响应靶点稳定性（DARTs）实验显示，WX006以剂量依赖的方式稳定NDUFS2蛋白，增强其抗蛋白水解降解的能力。细胞热位移分析（CETSA）显示WX006处理后的NDUFS2热变性温度（Tm）显著升高。DARTs和CETSA结果共同证实了WX006直接结合并稳定NDUFS2受体。
3.2.9. WX006 Demonstrates Safe and Effective Suppression of Hepatocellular Carcinoma (HCC) Growth In Vivo
在H22异位移植瘤模型中，为期一周的WX006治疗诱导了显著的肿瘤体积缩小。通过稳定的体重波动和所有剂量组正常的脏器指数证明了其全身安全性，H&E染色显示器官微结构完整，无药物诱导的病变。在Hepa1-6-luc原位模型中，体内荧光成像量化了治疗组肿瘤负荷的减少。同时， preserved visceral indices和主要器官中组织病理学异常的缺失增强了化合物在两种模型中的安全性。免疫组织化学分析显示Ki67增殖指数呈剂量反应性抑制。在比较疗效实验中，口服WX006或索拉非尼（50 mg/kg）5天后，生物发光成像量化显示WX006表现出优于索拉非尼的抗肿瘤功效，同时保持良好的安全性，未观察到显著的体重减轻或血液学毒性。
4. Discussion
本研究首次报道了WX006，一种具有独特分子结构的新型CAPE衍生物，它表现出显著的代谢驱动型肿瘤选择性细胞毒性，对正常细胞的脱靶效应极小。WX006通过竞争性占据复合物I的泛醌结合口袋，破坏电子传递动力学，最终引发能量危机和氧化还原灾难。正常细胞由于具有完整的补偿性生物能量通路和显著更高的抗氧化系统活性，因而在复合物I受损条件下保留代谢可塑性。WX006诱导的细胞死亡机制不同于经典通路，它引发了一种混合模式，其特征是脂质过氧化、ROS爆发、铜介导的蛋白毒性、线粒体功能障碍、ATP耗竭和内质网应激。靶向NAD+代谢为通过调节氧化还原平衡和克服化疗耐药性来增强HCC治疗提供了一种可行策略。与经典的线粒体 disruptors（如鱼藤酮）相比，WX006显示出更宽的治疗窗口。
5. Conclusions
采用基于结构的优化策略，研究团队合成了一系列新型CAPE衍生物作为肝细胞癌治疗的潜在前药。先导化合物WX006在Hep3B和Huh7细胞系中表现出强大的抗HCC活性，同时在小鼠原代肝细胞中毒性较低，表明其具有比CAPE更宽的治疗窗口。机制研究表明，WX006与NDUFS2的泛醌结合位点结合，抑制复合物I并破坏线粒体呼吸。这与破坏细胞内金属离子稳态相结合，改变了氧化还原平衡并诱导了铁死亡和铜死亡的特征。总之，CAPE的结构修饰产生了WX006，这是一种具有增强抗肿瘤效力和降低毒性的衍生物，代表了一个有前途的化疗候选药物。
