蒲公英花超临界CO2提取物的体外抗氧化、光防护活性及挥发性成分谱研究

《Plants》：In Vitro Antioxidant, Photoprotective, and Volatile Compound Profile of Supercritical CO2 Extracts from Dandelion (Taraxacum officinale L.) Flowers

本研究采用超临界CO2萃取（SFE-CO2）技术，从蒲公英（Taraxacum officinale L.）花朵中可持续地提取生物活性亲脂成分。结果表明，添加5%乙醇（EtOH）作为共溶剂可显著提高提取率、缩短提取时间，并大幅增强提取物的体外抗氧化活性（TEACCUPRAC和TEACABTS）、总酚（TPC）与总黄酮（TFC）含量、β-胡萝卜素浓度及光防护潜力（SPF值高达49.5）。挥发性成分分析揭示了单萜类、醛类和酯类为主导的香气特征。该研究为开发天然抗氧化剂和化妆品成分提供了新策略。

　　

引言

蒲公英（Taraxacum officinale L.）是菊科多年生开花植物，广泛分布于北半球。其不同部位在传统医药和食品中均有应用，富含多酚、黄酮类、植物甾醇、多糖、倍半萜和类胡萝卜素等植物化学成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、伤口愈合和胃肠道保护等多种生物活性。值得注意的是，蒲公英花是天然抗氧化剂的潜在来源。尽管已有研究采用常规方法（如浸渍、索氏提取、煎煮）从蒲公英不同部位提取生物活性物质，但对强化技术的研究主要集中在超声波辅助提取、酶辅助提取或其组合上，对超临界流体萃取（SFE）的关注相对较少。目前，CO₂因其临界条件相对较低（压力>7.38 MPa，温度>31.1 °C）、无毒、不易燃、成本低且被认定为安全（GRAS），成为最常用的超临界流体。SFE-CO₂作为一种可持续的提取方法，适用于从各种植物材料及其副产物中提取生物活性亲脂性组分，与传统使用烃类溶剂的固液萃取技术相比，更清洁、环保。此外，通过最小化有机溶剂的使用、避免去除有毒溶剂残留的需要，并通过适当选择压力和温度选择性回收热敏性化合物，SFE-CO₂特别适合应用于食品、营养保健品和制药领域。添加极性共溶剂（如乙醇、水）可进一步有助于分离极性更高的化合物。尽管该技术具有诸多优势和潜力，但现有文献有限，目前的研究主要集中在蒲公英种子，其次是叶子和花朵。鉴于市场对可持续、植物源性成分的需求日益增长，本研究旨在使用SFE-CO₂（添加或不添加乙醇作为共溶剂）从蒲公英花中分离亲脂性成分，并对所得提取物在提取率、选定植物化学指标（总酚、总黄酮和β-胡萝卜素含量）、挥发性成分谱和体外抗氧化能力方面进行表征。此外，除了体外抗氧化能力，植物提取物的光保护潜力（通常以防晒系数SPF表示）对于旨在用于植物皮肤病学和化妆品配方的成分也越来越重要。SPF作为材料衰减紫外线辐射能力的体外指标，可用于识别具有作为防晒产品天然辅助剂或增强剂潜力的提取物。因此，本研究也通过测定不同浓度下的SPF值来评估SFE-CO₂提取物的光保护潜力。据我们所知，这是首个将体外抗氧化和光保护评估与SFE-CO₂获得的亲脂性蒲公英花提取物中挥发性化合物组成分析相结合的综合研究。

蒲公英花SFE-CO₂提取物的制备

SFE-CO₂是一种广泛使用的强化提取方法，利用超临界CO₂从各种基质中分离脂质、挥发油和其他非极性成分。先前的研究已将其用于从蒲公英叶中提取β-香树脂醇和β-谷甾醇，以及从种子中分离各种生物活性化合物。然而，关于SFE-CO₂在蒲公英花中的应用以及所得提取物表征的信息仍然很少。本研究在35 MPa和40 °C的条件下进行SFE-CO₂，这些条件常被报道为从蒲公英种子和叶中回收热敏性化合物的最佳条件，也能确保维持足够的CO₂密度（934.9 kg/m³）以溶解非极性化合物，同时最小化热降解风险。蒲公英花的SFE-CO₂动力学（添加和不添加共溶剂）显示出植物材料超临界CO₂提取典型的三阶段特征曲线，依次经历初始快速提取阶段、下降提取速率阶段和最终扩散控制的平衡阶段。对于纯CO₂，约50%的最终产率在恒速提取期的前15分钟内获得，反映了易于获取的表面亲脂性化合物（如精油和蜡质）的快速去除。随后是下降提取速率阶段，在60分钟内达到约80%的总产率，接着是扩散控制阶段，在120分钟后达到平衡，最终产率为每100克蒲公英花4.8克。加入5%（体积/体积）乙醇作为共溶剂增加了溶剂极性，改善了对中等极性化合物的回收，并减少了基质-溶质相互作用，从而缩短了提取过程，在90分钟后达到平衡，并将最终产率提高了约50%，达到7.2克/100克蒲公英花。为便于产率比较，进行了己烷索氏提取，6小时后产率为6.6克/100克蒲公英花，进一步凸显了SFE-CO₂，尤其是与极性共溶剂结合时的效率和时间优势。先前的研究已经证明了SFE-CO₂在分离有价值的非极性蒲公英成分方面的有效性，主要集中在种子和叶子上。据我们所知，唯一一项将SFE-CO₂应用于蒲公英花（在20 MPa和50 °C下）的可用研究未报告提取物产率，并且没有先前的工作考察过蒲公英花SFE-CO₂（添加或不添加乙醇作为共溶剂）的提取动力学或产率。除了产率，SFE还具有额外优势，如由于超临界CO₂的高扩散性和低粘度而缩短提取时间。此外，CO₂作为溶剂的选择性和可调性使得通过调整压力和温度能够靶向回收亲脂性化合物。最后，SFE-CO₂具有多种环境效益，包括无毒、不易燃、不留下溶剂残留或需要后处理步骤。总之，这些发现证实了SFE-CO₂，特别是与极性共溶剂结合时，是从植物基质中分离生物活性亲脂性组分的一种可持续且有效的替代传统提取方法。

蒲公英SFE-CO₂提取物的体外抗氧化和光保护特性

评估植物来源提取物的生物活性特性对于更深入地了解其在健康和化妆品配方中的潜在应用至关重要。在本部分研究中，使用CUPRAC和ABTS测定法评估了蒲公英花SFE提取物的体外抗氧化能力、总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）和β-胡萝卜素浓度。这些特定的植物化学标记物与提取物中和自由基的能力以及有助于光保护密切相关。此外，还测定了提取物的防晒系数（SPF），以探索其作为天然紫外线过滤剂的潜力。共溶剂的添加显著提高了蒲公英花提取物的抗氧化能力。按提取物质量计算，TEAC_CUPRAC值从84.4毫克TE/克提取物几乎翻倍至169.8毫克TE/克提取物，而TEAC_ABTS值增加了约11倍（从17.5毫克TE/克提取物增至193.8毫克TE/克提取物），表明整体抗氧化潜力（ABTS自由基清除能力和CUPRAC还原能力）显著增强。这一增加与类胡萝卜素含量（从28.2毫克/克提取物增至44.7毫克/克提取物）、TFC（从13.1毫克QE/克提取物增至23.9毫克QE/克提取物）和TPC（从29.1毫克GAE/克提取物增至91.3毫克GAE/克提取物）值提高1.6至3倍一致。鉴于SFE-CO₂+ 5% EtOH的提取产率更高，当按植物材料质量计算时，这些结果转化为按比例更大的值。观察到的体外抗氧化能力值依赖于测定方法的改进与方法的化学性质及提取物的预期组成一致。在CUPRAC测定中，抗氧化能力被量化为样品的整体还原能力，基于其将Cu(II)还原为Cu(I)从而形成有色Cu(I)-新铜试剂络合物的能力。相比之下，ABTS测定量化了样品清除ABTS自由基阳离子的能力，通过电子转移和/或氢原子转移机制进行测量，并在~734 nm处测量吸光度的降低。在ABTS和CUPRAC测定中，TEAC值的响应通常随着酚类/黄酮类抗氧化剂的浓度和氧化还原电位而增加。此外，CUPRAC在近中性pH下表现良好，可以检测亲水性和亲脂性抗氧化剂，而ABTS^•+对能够离域电荷的酚类和共轭体系特别敏感。因此，添加共溶剂后ABTS响应更强（按提取物基础计算为11倍）与TPC增加3倍和TFC增加近2倍相符。引入少量乙醇增强了超临界相的极性和氢键结合能力，从而改善了中等极性酚类和黄酮类化合物的溶解度和传质，这些化合物在纯CO₂（其溶剂化行为类似于己烷）中提取效果较差。此外，与TEAC_CUPRAC相比，TEAC_ABTS的增加更大可能归因于类胡萝卜素含量，因为这些植物化学物质主要作为自由基猝灭剂而非强还原剂。本研究的结果与Milovanovic等人先前的报告一致，他们使用纯SFE-CO₂对蒲公英种子进行脱脂，随后用乙醇作为共溶剂对脱脂材料进行第二次提取。他们报告称，乙醇提取物的TPC和TFC分别增加了4倍和5倍，而类胡萝卜素含量保持不变。总体而言，所测试的蒲公英花提取物的TPC和TFC值高于先前报道的SFE-CO₂种子提取物的范围（TPC 5.5–17.1 mg GAE/g E；TFC 0.2–1.3 mg QE/g E）。与种子相比，花中更高的酚类和黄酮含量是预期的，并与最近发表的LC-MS/MS数据一致，该数据报告花中总黄酮（苷元、苷、双黄酮和黄酮木脂素）含量为每克花4.7-4.9毫克。蒲公英物种中的类胡萝卜素水平可能因物种、分析的植物部位、地理位置、气候条件和其他因素而有很大差异。例如，报道的蒲公英叶类胡萝卜素含量范围从巴西采集样品中的0.1毫克/克干重到波兰获得的样品中的0.9毫克/克干重。相对较高的水平（约1毫克/克干燥植物材料），与本研究中获得的水平相当，也有报道用于蒙古蒲公英（T. formosanum）。总体而言，可以预期花中类胡萝卜素水平较高，因为它们强烈的黄色色素沉着与类胡萝卜素积累密切相关。尽管有文献记载了极性蒲公英提取物的体外抗氧化能力，但关于除种子外的地上部分（尤其是花）非极性馏分活性的信息仍然非常有限。例如，Hu和Kits报告称，蒲公英花提取物的乙酸乙酯馏分在稳定的DPPH自由基模型中表现出比水馏分更高的抗氧化活性（在53 μg/mL时清除率为94%对52%）。两种馏分还保护超螺旋DNA免受位点特异性和非位点特异性羟基自由基引起的损伤。蒲公英SFE-CO₂和SFE-CO₂+ 5% EtOH提取物的紫外-可见光谱在紫外和可见光范围内显示出不同的吸收模式，表明其潜在的光保护特性存在差异。乙醇作为共溶剂的添加产生的提取物在UV-C（200–280 nm）、UV-B（280–315 nm）和UV-A（315–400 nm）区域具有更高的吸收能力，这与其显著更高的TPC、TFC和增强的体外抗氧化活性一致。相比之下，纯SFE-CO₂提取物显示出较低的紫外线吸收，但在可见紫蓝光区域（400–480 nm）表现出相对较高的强度，有助于可见光过滤特性。光保护潜力，以SPF值表示，也显示出明显的浓度依赖性增加。对于SFE-CO₂+ 5% EtOH提取物，SPF从0.05 mg/mL时的约3.0上升到1.00 mg/mL时的49.5，相应的UV-B吸收率从66%增加到98%。相比之下，纯SFE-CO₂提取物显示出更温和的增加，SPF值在相同浓度范围内从0.8上升到13.9，在1.00 mg/mL时达到93%的UVB吸收率。尽管体外SPF值不能直接等同于体内ISO标准，但Mansur方法被广泛接受用于初步筛选，并与标准化SPF概念合理吻合。该方法评估290–320 nm范围内的加权吸光度，该区域红斑效应UV-B辐射最为强烈。根据欧盟委员会建议2006/647/EC，防晒功效分为四个等级：低（SPF 6–10）、中（SPF 15–25）、高（SPF 30–50）和非常高（SPF > 50）。使用此框架进行定性比较，SFE-CO₂+ 5% EtOH提取物在1.00 mg/mL时（SPF为49.5）属于“高”类别的上限范围，接近“非常高”的阈值（>50），而纯SFE-CO₂提取物在测试浓度范围内提供低至中等的保护。EtOH修饰的SFE-CO₂提取物中更高的TPC、TFC和类胡萝卜素水平为其显著更高的SPF值和UV-B吸收潜力提供了合理的解释。此外，驱动SPF性能的组成因素与抗氧化测定中的趋势一致。黄酮类化合物在近紫外光谱（吸收带I–II；300–400 nm）有吸收，贡献直接紫外线过滤和间接抗氧化保护，而类胡萝卜素主要作为单线态氧和自由基猝灭剂，在可见光范围内有强吸收，并通过减轻紫外线暴露引发的氧化级联反应来补充酚类物质的活性，同时也作为抗炎剂有助于减少光损伤。因此，未来的研究应优先对单个酚酸和黄酮类化合物进行靶向分析和定量，以建立更精确的构效关系，从而阐明蒲公英提取物光保护效应的机制。需要注意的是，关于蒲公英提取物护肤效果的数据，尤其是其紫外线防护特性，仍然非常有限，只有少数报告证实了极性馏分的活性。例如，Yang和Li表明，蒲公英叶和花的水提取物（而非根）可以有效地保护人类真皮成纤维细胞免受UV-B诱导的损伤和过氧化氢诱导的氧化应激，主要是通过减少活性氧的产生和抑制基质金属蛋白酶的活性。此外，在另一项研究中，使用超声波辅助提取法（使用H₂O、EtOH和EtOH/H₂O混合物（50%，体积/体积））从蒲公英茎和叶制备的六种提取物中，茎的 hydroethanolic 提取物在10 mg/mL浓度下显示出最强的UV-A和UV-B吸收，尽管其有效性低于绿原酸。据我们所知，这是关于非极性蒲公英花提取物体外光保护活性的首次报告。

蒲公英花和SFE-CO₂提取物的挥发性化合物谱

采用SPME-GC × GC-TOF-MS比较了蒲公英花