番茄SlABCG基因家族的全基因组鉴定及其在盐碱胁迫耐受性中的功能解析

《Genes》：Genome-Wide Characterization of SlABCG Genes in Tomato Reveals Their Role in Saline–Alkali Tolerance

本文通过系统发育、基因结构、共线性及表达模式分析，鉴定了番茄41个SlABCG基因，揭示其通过调控过氧化物酶（POD）、MAPK信号通路等关键因子响应盐碱胁迫的分子机制，为番茄抗逆育种提供了重要靶点（如SlABCG7）和理论依据。

　　

番茄SlABCG基因家族的全基因组鉴定及其在盐碱胁迫耐受性中的作用

引言

ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）蛋白是广泛存在于植物、动物和原核生物中的一类膜结合转运蛋白，其典型特征包含核苷酸结合域（Nucleotide-Binding Domain, NBD）和跨膜结构域（Transmembrane Domain, TMD）。ABC蛋白家族根据其结构特征可分为ABCA至ABCI等多个亚家族，其中ABCG亚家族是植物中成员数量最多、功能最为多样的亚群之一。ABCG蛋白在植物中参与多种生物学过程，包括雄性生殖、植物激素运输以及非生物胁迫响应等。例如，水稻中的ABCG7突变体在盐胁迫下表现出叶片萎蔫严重、存活率低以及耐盐性降低的表型；拟南芥AtABCG36通过减少植株体内的钠含量来增强耐盐性。然而，尽管番茄中的ABCG基因亚家族已被初步鉴定，但其在盐碱等非生物胁迫下的具体功能机制仍不清楚。非生物胁迫是影响番茄产量和品质的关键限制因素，其中土壤盐碱化尤为突出。因此，解析番茄ABCG基因家族的特征及其在盐碱胁迫应答中的作用，对于阐明番茄耐逆机制和培育抗逆品种具有重要的理论和实践意义。

材料与方法

本研究以Micro-Tom番茄为材料，在幼苗长出4-6片真叶后，分别用霍格兰营养液（对照，CK）以及添加了300 mM混合盐碱溶液（NaCl:Na₂SO₄:NaHCO₃:Na₂CO₃摩尔比为1:9:9:1，pH = 8.6 ± 0.1）的处理组进行水培培养。在处理后0小时、4小时和8小时分别取样，进行转录组测序（RNA-seq）。利用Trimmomatic软件对原始测序数据进行质控，使用HISAT2将高质量序列比对到番茄参考基因组（SL3.0），并通过StringTie和Salmon软件进行转录本组装和表达量（TPM）定量。差异表达基因（DEGs）的分析采用DESeq2和edgeR软件包，筛选标准为错误发现率（FDR）< 0.05且|log₂（Fold Change）| ≥ 1。同时，研究还从NCBI数据库获取了番茄在脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）、低温、光和赤霉素处理下的转录组数据（BioProject编号分别为PRJNA947059、PRJNA846581、PRJNA484882、PRJNA270083等），以分析SlABCG基因在不同胁迫下的表达模式。此外，利用MEGA 7.0软件构建番茄和拟南芥ABCG蛋白的系统发育树（邻接法，bootstrap=1000）；通过GSDS和MEME服务器分析基因结构和保守基序；利用PlantCARE数据库预测启动子区域（转录起始位点上游2 kb）的cis-作用元件；使用TBtools进行染色体分布和基因复制事件分析；通过STRING数据库预测蛋白互作网络，并用Cytoscape可视化；采用KOBAS进行KEGG通路富集分析。最后，通过qRT-PCR对25个上调基因的表达进行验证，以GAPDH为内参基因，使用2^?ΔΔCt方法计算相对表达量。

结果

SlABCG基因的特征

从番茄参考基因组Solanum_lycopersicum.SL3.0中共鉴定出41个SlABCG基因。这些基因编码的蛋白长度差异显著，范围从597个氨基酸（SlABCG4）到4249个氨基酸（SlABCG50），分子量介于66.46 kDa至482.64 kDa之间，等电点（pI）分布在5.98至9.28。系统发育分析将41个番茄SlABCG和43个拟南芥AtABCG蛋白序列划分为5个明显的进化枝（Cluster）。其中，枝V包含的成员最多（14个SlABCG和16个AtABCG），而枝II和枝IV中的番茄成员（如SlABCG8/SlABCG9和SlABCG15/SlABCG16）与拟南芥同源基因表现出保守的直系同源关系，提示它们可能具有相似的功能。

SlABCG基因和蛋白结构分析

保守结构域分析表明，SlABCG蛋白包含典型的ABC转运蛋白结构，其复合物中通常含有四个保守结构域，包括核苷酸结合域（NBD）和跨膜结构域（TMD）。基因结构显示，SlABCG基因的外显子数量从1个到58个不等，且亲缘关系相近的基因往往具有相似的内含子-外显子分布模式。MEME分析鉴定出6个保守基序（Motif 1-6），其中Motif 2和Motif 3属于ABC_trans（NBD）结构域，而Motif 5和Motif 6属于ABC2_membrane（TMD）结构域。这些基序的分布模式与系统发育分类高度一致，进一步支持了进化关系的可靠性。

SlABCG基因的共线性和基因复制分析

染色体定位显示，41个SlABCG基因不均匀分布在番茄的11条染色体上，其中5号和11号染色体上的基因数量最多（各7个）。共线性分析发现了7个片段复制对，随机分布于8条染色体上，表明片段复制是驱动番茄ABCG亚家族扩张的主要动力。此外，番茄与拟南芥之间的比较基因组学分析揭示了35个共线性基因对（涉及21个SlABCG和24个AtABCG），而番茄与马铃薯之间则存在39个共线性基因对（涉及21个SlABCG和27个马铃薯ABCG）。这些结果为了解ABCG基因在物种间的进化关系及功能预测提供了依据。

SlABCG基因在非生物胁迫下的表达模式

启动子顺式作用元件预测发现，SlABCG基因的启动子区域富含多种与非生物胁迫响应相关的元件，包括对水杨酸（SA）、低温、赤霉素、ABA、伤害、生长素和光等响应的元件。对公共转录组数据的重新分析表明，SA处理可诱导13个SlABCG基因上调表达，低温处理诱导7个基因上调（同时有7个基因下调），赤霉素处理诱导1个基因上调（另有1个下调）。而ABA和光处理下未发现显著差异表达的SlABCG基因。这些结果提示，SlABCG基因可能特异性地参与番茄对SA、低温和赤霉素胁迫的响应。

SlABCG基因在番茄盐碱胁迫中的功能

对盐碱胁迫处理的番茄进行RNA-seq分析，在4小时和8小时处理组与对照（CK）的比较中，分别鉴定出2862个和1863个上调差异表达基因（DEGs），以及1216个和1561个下调DEGs。共有2777个基因在两组比较中均为差异表达，其中1563个基因在胁迫过程中呈现持续上调的表达趋势。KEGG富集分析显示，这些持续上调的基因显著富集于氧化磷酸化、植物MAPK信号通路、谷胱甘肽代谢以及光合作用等通路。进一步分析发现，有6个SlABCG基因（SlABCG1、SlABCG7、SlABCG13、SlABCG30、SlABCG51、SlABCG63）位于持续上调的基因簇中（Cluster 3和Cluster 4）。蛋白互作网络预测表明，这些SlABCG蛋白可能与多种功能蛋白存在相互作用。例如，SlABCG7与13个蛋白存在互作，其中包括过氧化物酶（POD）、ENTH结构域包含蛋白和细胞色素P450酶；SlABCG63则与MPK2（MAPK激酶）存在互作。这些互作关系暗示SlABCG可能通过调控抗氧化系统（如POD）和信号转导通路（如MAPK级联）来参与盐碱胁迫响应。

SlABCG基因调控番茄盐碱胁迫应答的验证

qRT-PCR验证结果显示，所选的25个上调基因（包括6个SlABCG基因、其预测靶基因及其他相关基因）在盐碱胁迫处理下均显著上调。转录组数据与实验验证相结合发现，SlABCG1、SlABCG30、SlABCG51和SlABCG63的表达显著上调，但其预测的靶基因并未对胁迫做出响应，提示这些SlABCG可能通过调控其他未知靶基因来增强番茄的耐盐碱性。值得注意的是，SlABCG13及其预测的靶基因ENTH在胁迫下均呈现上调表达，表明SlABCG13可能通过促进ENTH的表达来发挥作用。尤为重要的是，SlABCG7不仅自身表达受SA诱导，还能显著提高两个过氧化物酶基因的表达水平，这暗示SlABCG7可能参与了SA介导的番茄盐碱胁迫耐受性增强机制。

讨论

本研究对番茄ABCG转运蛋白亚家族进行了全面的生物信息学鉴定和功能分析。与先前报道的70个SlABCG基因相比，在新版本基因组中仅确认了41个，这可能源于基因组注释的更新，去除了假基因和冗余注释。进化分析将SlABCG分为5枝，与拟南芥同源基因的聚类为功能推测提供了线索。基因复制事件分析表明，片段复制是番茄ABCG家族扩张的主要驱动力。启动子分析和转录组数据共同证实了SlABCG基因参与SA、低温和赤霉素胁迫响应，扩展了人们对ABCG蛋白在非生物胁迫中作用的认识。盐碱胁迫下的转录组分析揭示了6个关键的SlABCG基因，它们与过氧化物酶、MAPK信号通路等关键因子存在互作网络，这为解析其分子机制提供了重要方向。例如，MAPK级联反应和抗氧化酶系统在植物盐胁迫应答中的重要作用已被广泛报道，SlABCG与这些系统的关联提示了其潜在的功能途径。然而，本研究提供的差异表达分析是组织层面的平均结果，未来需要利用更精确的原位技术来揭示其在细胞特异性以及激素时间窗口内的复杂时空动态响应。

结论

本研究成功鉴定了番茄基因组中的41个SlABCG基因，系统分析了其进化关系、基因/蛋白结构特征、染色体分布、复制事件以及表达模式。研究发现该家族基因受赤霉素、低温和SA等多种胁迫信号的调控，并在盐碱胁迫下具有持续上调表达的潜力。蛋白互作预测表明，这些基因可能通过调控过氧化物酶（POD）、MPK2等关键因子形成复杂的网络来协同增强番茄的盐碱耐受性。该研究为深入理解番茄ABCG家族基因的功能及其在抗逆育种中的应用提供了重要的数据支持和理论依据。