《Advanced Therapeutics》：MMP2-Responsive Liposomes Targeting LDLR Enhance the Effectiveness of Anti-Cancer Drugs in Treating Melanoma
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本研究开发了一种新型双功能脂质体递送系统，通过修饰载脂蛋白E肽（mApoE）靶向低密度脂蛋白受体（LDLR），并利用基质金属蛋白酶2（MMP2）可切割脂肽实现肿瘤微环境响应性药物释放。该系统负载MEK1/2抑制剂Pimasertib，在体外实验中显著降低了黑色素瘤细胞活力，抑制了3D肿瘤球体的生长和侵袭能力，为克服肿瘤耐药性和提高靶向治疗精准度提供了新策略。
文章内容归纳总结
1 引言
黑色素瘤作为最具侵袭性的皮肤癌类型，其治疗面临着肿瘤异质性、药物耐药性以及药物递送效率低等多重挑战。尽管靶向治疗（如BRAF和MEK抑制剂）和免疫疗法已取得进展，但仍有约60%的患者无法获得完全缓解或出现快速复发。纳米肿瘤学，特别是脂质体技术，通过改善药代动力学和靶向性，为克服这些障碍提供了新希望。
脂质体作为纳米级药物载体，具有高载药量、保护药物、改善生物利用度以及主动靶向等优势。其中，主动靶向策略通过利用肿瘤细胞表面过表达的受体，如低密度脂蛋白受体（LDLR），可以显著增强药物载体的递送效率。此外，刺激响应性纳米颗粒能够对肿瘤微环境中的特定生化信号（如基质金属蛋白酶MMPs）做出反应，实现药物的精准控制释放。
本研究旨在设计并验证一种新型的“一体化”药物递送系统。该系统利用脂质体作为载体，通过表面修饰的载脂蛋白E肽（mApoE）靶向肿瘤细胞过表达的LDLR，同时利用MMP2可切割的脂肽实现肿瘤微环境响应性药物释放。该双功能脂质体负载了MEK1/2抑制剂Pimasertib，旨在提高药物在黑色素瘤治疗中的递送效率和疗效。
2 结果与讨论
2.1 MMP响应性杂合脂肽的开发
研究首先合成了MMP2响应性杂合脂肽。通过微波辅助固相肽合成（MW-SPPS）技术，合成了MMP2蛋白酶识别的核心序列GPLGIAGQ。随后，通过化学偶联，将硬脂酸和磷脂（DOPE）作为疏水“锚点”连接到该肽序列上，构建了四种杂合脂肽：PN-Ac-DOPE、PN-St-DOPE、PS1-St-DOPE和PS2-St-DOPE。其中，PN-Ac-DOPE作为无间隔基团的模型分子，用于验证合成策略；PN-St-DOPE将N端乙酰基替换为硬脂酸链；PS1-St-DOPE和PS2-St-DOPE则分别插入了β-丙氨酸（短间隔基）和6-氨基己酸（长间隔基），以研究间隔基长度对脂肽功能的影响。这些脂肽均通过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）进行了表征，确认了其结构和纯度。
2.2 脂质体的表征
利用上述合成的杂合脂肽，研究团队制备了负载Pimasertib的脂质体。通过脂质膜水化法和探头超声法制备了单层脂质体，并对其进行了表面功能化修饰，连接了靶向LDLR的mApoE肽。动态光散射（DLS）分析显示，所有脂质体粒径均小于150纳米，多分散指数（PDI）约为0.2，表面电位约为-40毫伏，表明其具有良好的单分散性和稳定性。冷冻透射电镜（cryo-TEM）图像进一步证实了脂质体为球形单层囊泡，粒径在100-200纳米之间。
药物包封率测定显示，Pimasertib的包封效率为80 ± 10%，对应的药物/脂质（D/L）摩尔比约为0.2，表明制备方法具有较高的载药效率。mApoE在脂质体表面的偶联产率为60%-70%。长期稳定性实验表明，载药脂质体在4°C和室温下储存21天，粒径和PDI均保持稳定，未出现明显聚集。
为了验证脂质体对MMP2的响应性，研究将负载荧光探针钙黄绿素（calcein）的脂质体与活化的MMP2酶共同孵育。结果显示，在MMP2存在下，钙黄绿素的释放量显著增加，证实了脂质体对MMP2的响应性。其中，含有R2脂肽（PS2-St-DOPE）的脂质体表现最佳，这可能是由于较长的间隔基（6-氨基己酸）使MMP2靶向序列（GPLGIAGQ）在脂质体表面暴露得更好。
为了筛选合适的肿瘤模型，研究评估了三种人源细胞系（黑色素瘤A375、肺腺癌A549和胶质瘤GLI36R）中MMP2和LDLR的表达水平。Western blot分析显示，A375细胞中MMP2和LDLR的表达水平均高于其他两种细胞系。细胞活力实验（MTT法）进一步证实，双功能化脂质体（P@LPs-mApoE-R2）在A375细胞中表现出最强的抗增殖活性，且其响应性与MMP2水平呈负相关。基于此，后续实验选择黑色素瘤作为主要研究对象。
2.3 脂质体降低黑色素瘤细胞活力并诱导凋亡
研究在两种黑色素瘤细胞系（WM793B，源自原发性垂直生长期肿瘤；SKMEL-28，源自淋巴结转移）中验证了脂质体的有效性。Western blot分析证实，这两种细胞系均表达LDLR，且WM793B细胞高表达前体MMP2（非活性形式），而两种细胞均表达活性MMP2。
细胞实验设计包括：空白脂质体、游离Pimasertib、仅靶向脂质体（P@LPs-mApoE-NR）和双功能化脂质体（P@LPs-mApoE-R2）。MTT法和流式细胞术分析显示，双功能化脂质体（P@LPs-mApoE-R2）在72小时内显著降低了细胞活力，并诱导了更高比例的细胞凋亡（亚G1期细胞增多）。
机制研究表明，Pimasertib作为MEK1/2的高选择性抑制剂，能够阻断MAPK信号通路。Western blot分析显示，经双功能化脂质体处理的细胞中，磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的水平显著降低，表明药物被有效释放并作用于其靶点。此外，细胞增殖标志物细胞周期蛋白B1（Cyclin B1）和细胞存活标志物生存素（Survivin）的表达也显著下调，进一步证实了双功能化脂质体在抑制细胞增殖和促进细胞死亡方面的优越性。
2.4 脂质体通过诱导凋亡降低肿瘤球体活力和生长
为了更真实地模拟体内肿瘤结构，研究构建了3D黑色素瘤球体模型。与2D培养相比，3D球体结构更复杂，药物渗透难度更大。因此，研究提高了药物剂量进行实验。
结果显示，双功能化脂质体（P@LPs-mApoE-R2）能够显著降低3D球体的活力，并抑制球体的生长（球体面积减小）。碘化丙啶（PI）染色实验进一步证实，双功能化脂质体处理组中，球体内部的细胞死亡比例显著高于其他处理组。这表明，双功能化脂质体不仅能够有效穿透3D球体结构，还能在球体内部释放药物，诱导细胞凋亡。
2.5 脂质体降低黑色素瘤球体的侵袭能力
黑色素瘤具有高度侵袭和转移的特性。为了评估脂质体在模拟体内肿瘤微环境中的作用，研究将黑色素瘤球体植入I型胶原基质中，模拟细胞外基质环境。
侵袭实验结果显示，双功能化脂质体（P@LPs-mApoE-R2）处理组，球体细胞的侵袭面积和侵袭距离均显著减小。为了探究其分子机制，研究检测了上皮-间质转化（EMT）标志物的表达。Western blot分析显示，双功能化脂质体处理显著下调了EMT关键转录因子Slug和Snail的表达。这一结果从分子水平解释了双功能化脂质体能够抑制黑色素瘤细胞侵袭能力的原因。
3 结论
本研究成功开发了一种新型双功能化脂质体药物递送系统。该系统通过mApoE肽靶向LDLR，利用MMP2响应性脂肽实现肿瘤微环境特异性药物释放。体外实验证实，该系统能够显著提高MEK1/2抑制剂Pimasertib在黑色素瘤细胞中的递送效率和抗肿瘤活性，有效抑制了2D和3D肿瘤模型的生长、侵袭以及EMT进程。该策略不仅为黑色素瘤治疗提供了新思路，也为其他表达LDLR和MMPs的肿瘤治疗提供了潜在的应用前景。
