《Journal of Extracellular Vesicles》：NETosis-Like Response Triggered by Extracellular Vesicle (EV)-Delivered Viral Nucleic Acid, a Novel Cellular Immune Mechanism in Crustacean
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本文报道了细胞外囊泡（EVs）在甲壳类动物抗病毒免疫中的新机制。研究发现，在白斑综合征病毒（WSSV）感染过程中，血细胞分泌的EVs能包装病毒mRNA wsv271，并将其递送至中性粒细胞样细胞；该mRNA被翻译成病毒蛋白后，与Toll4受体的TIR结构域相互作用，招募髓样分化因子88（MyD88），从而激活P38-丝裂原活化蛋白激酶（P38-MAPK）信号通路；活化的P38进一步促进肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）的磷酸化及核转位，催化组蛋白H3瓜氨酸化，最终触发NETosis样反应，有效抑制病毒扩散。该研究不仅通过单细胞转录组学鉴定了甲壳类血细胞中的中性粒细胞样细胞，还揭示了一种由EVs递送病毒核酸介导的新型NETosis诱导机制，为理解无脊椎动物先天免疫及水产养殖抗病育种提供了新视角。
1 Introduction
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是由几乎所有细胞类型释放的膜包被结构。这些纳米级的囊泡主要来源于细胞内溶酶体内陷形成的多泡体（Multivesicular Bodies, MVBs）。通过包装蛋白质、脂质和核酸等多种生物活性分子，EVs可作为细胞间通讯的关键介质。目前研究表明，EVs参与免疫反应、组织修复和心血管疾病等多种生理病理过程的调控。例如，抗原呈递细胞（如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞）分泌的EVs可将其携带的抗原呈递给主要组织相容性复合体（MHC）以激活T细胞，启动免疫反应。鉴于EVs的生物发生和功能在动物中高度保守，通过比较不同生物体中EVs的分子组成、功能和机制来研究生物功能的进化是可行的。
NETosis，也称为中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）介导的程序性细胞死亡，是一种细胞免疫反应。NETosis诱导剂（如细菌、真菌和病毒）可促进髓过氧化物酶（MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）的转录和翻译；随后PAD4转位至细胞核，瓜氨酸化组蛋白，导致染色质结构改变和染色质DNA解聚。最终，核膜降解后，由NE、MPO和其他胞质抗菌蛋白组成的颗粒与解聚的染色质DNA结合，形成杀菌网状结构并释放到细胞外空间。这些物质和组蛋白与染色质DNA结合，常被用作NETosis的指标。此外，激活的中性粒细胞中氧化爆发诱导的活性氧（ROS）积累也被认为是NETs形成的关键指标。有报道称，在细菌感染的海岸蟹血细胞中观察到胞外诱捕网结构，这种条件下诱导的细胞死亡被称为ETosis。研究人员发现，在病原体感染期间，海岸蟹中EVs的分布与组蛋白瓜氨酸化水平显著相关，而组蛋白瓜氨酸化也是脊椎动物NETosis的指标。然而，鉴于甲壳类动物的血细胞由多种具有不同免疫功能的细胞类型组成，关于具体哪种细胞类型发生ETosis尚无明确结论，其激活的分子机制也尚未探索。
甲壳类动物的开放式循环系统是一个典型特征，血细胞、营养物质和氧气在血淋巴中共同循环。在这种背景下，EVs可以通过这种循环系统被运输到几乎所有组织和器官以发挥生物学功能。此外，甲壳类属于无脊椎动物，其抵抗病原微生物感染主要依靠先天免疫系统，因此可以排除获得性免疫对感染过程的影响。这些考虑表明，与脊椎动物相比，甲壳类是研究EVs介导先天免疫反应的更合适的生物系统。然而，作为一个热门研究领域，关于EVs如何参与抗病毒免疫反应的研究主要集中在高等生物中；通过研究无脊椎动物模型中EVs介导的先天免疫，极有可能获得新的免疫学知识。
为了系统阐明EVs依赖性调控通路在病毒感染期间调节宿主先天免疫反应的作用，我们采用感染白斑综合征病毒（WSSV）的拟穴青蟹作为研究模型。WSSV对甲壳类动物具有高致病性，由WSSV引起的白斑综合征是我国二类动物疫病，目前尚无特异有效的干预措施来缓解WSSV相关疾病。我们的研究结果表明，EVs包装的病毒核酸wsv271可被递送至邻近的中性粒细胞样细胞，并进一步激活NETosis样反应以抑制病毒感染。因此，我们的发现揭示了一种新的EVs依赖性NETosis诱导和调控机制，不仅扩展了我们对EVs介导的先天免疫反应的理解，也为水产养殖业应对病毒感染提供了细胞靶点。
2 Materials and Methods
本研究所用拟穴青蟹取自牛田洋养殖场。实验动物处理依据江西省科学技术厅制定的《实验动物管理与使用条例》。健康青蟹（约50克/只）在25°C、20‰盐度海水中驯化72小时。首先使用WSSV特异性引物进行PCR，确保处理前青蟹无WSSV感染。然后，每只蟹注射200 μL WSSV悬液（1×106颗粒/mL）。注射不同时间后，随机选取9只蟹收集血淋巴和组织备用。使用Premix Ex Taq（探针qPCR）、WSSV特异性引物和TaqMan探针进行RT-qPCR检测WSSV拷贝数。
采用差速离心结合蔗糖密度梯度离心法从青蟹血淋巴中分离EVs。通过透射电子显微镜（TEM）观察EVs形态，纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定其粒径和浓度，蛋白质印迹法（Western blot）检测EVs标志蛋白CD9、CD63、TSG101以及内质网标志蛋白Calnexin以确定纯度。
根据wsv001、wsv091、wsv271、wsv277、wsv447、GFP、ERK1、ERK2、P38、Toll4、MyD88和PAD4的序列，设计特异性小干扰RNA（siRNA）。使用体外转录T7试剂盒合成靶向上述基因的siRNA。然后，每克蟹注射1 μg siRNA。注射不同时间后，每组随机选取3只蟹储存备用。注射GFP-siRNA的蟹设为对照组。
使用RNAiso Plus提取血细胞总RNA。使用PrimeScript RT试剂盒以Oligo-dT引物合成第一链cDNA。使用TB Green Premix Ex Taq II在QuantStudio 5系统上进行定量PCR。每个20 μL反应体系包含10 μL TB Green mix、0.8 μL各引物（10 μM）、2 μL cDNA模板（5倍稀释）和6.4 μL无核酸酶水。PCR循环数设为35。使用2?ΔΔCt算法计算mRNA相对表达量。以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参基因。
样品使用含1 mM PMSF的RIPA裂解液裂解，95°C变性5分钟，4°C 13,000 × g离心5分钟。上清与5×SDS上样缓冲液混合，通过12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至硝酸纤维素膜。膜用Quick-Block Western封闭液封闭，4°C与一抗孵育过夜。TBST洗涤后，与二抗孵育，使用ECL底物进行检测。所用一抗包括CD63、CD9、TSG101、Calnexin、Tubulin、MPO、PTX3、histone-H2A、histone-H3、MyD88、ERK1、ERK2、Toll4、NE1、PAD4、Tyr/Ser/Thr磷酸化抗体、histone-H3（瓜氨酸R2+R8+R17）抗体等。P38和wsv271抗体由本实验室制备。检测总细胞蛋白时，以Tubulin作为内参；检测胞质蛋白时，以Tubulin作为内参；检测细胞核蛋白时，以histone H3作为参考蛋白；检测EVs蛋白时，以CD63作为参考蛋白。
收集血细胞，用RIPA裂解液裂解，BCA法测定蛋白浓度。按照说明书使用MPO-DNA ELISA试剂盒和瓜氨酸化组蛋白H3 ELISA试剂盒进行检测。100 μL蛋白裂解液与相应底物在96孔板中交联孵育30分钟，清洗缓冲液洗涤后，加入100 μL免疫测定复合物溶液孵育10分钟，随后加入50 μL显色底物溶液，用酶标仪检测450 nm吸光度。
取注射PBS、WSSV、EV-PBS和EV-WSSV的蟹鳃丝，4%多聚甲醛固定24小时。经梯度乙醇（50%至100%）脱水，二甲苯-乙醇（50%二甲苯/乙醇至100%二甲苯）透明，低熔点石蜡包埋。垂直于鳃弓轴向切片（5 μm厚度），苏木精-伊红（HE）染色后，用抗淬灭封片剂封片观察。
青蟹血细胞铺于经10%多聚酸预处理的共聚焦培养皿中，4%多聚甲醛室温固定15分钟。70%乙醇脱水后，4°C过夜孵育。加入杂交液孵育30分钟，随后与500 nM wsv271荧光探针4°C孵育16小时。PBS洗涤3次，DAPI染料溶液染色5分钟，共聚焦显微镜观察。
血细胞用含2.5%甘油和2%甲醛的0.1 M PBS（pH 7.4）4°C固定至少2小时。PBS洗涤3次后，依次经不同浓度乙醇（30%、50%、70%、90%、100%）脱水，无水乙醇处理两次（每次20分钟）。使用超临界二氧化碳干燥仪干燥样品。干燥样品用碳胶带固定在铝载物台上，并喷涂10 nm金钯。使用二次电子探测器在10千伏加速电压和8-12 mm工作距离下采集图像。未感染细胞作为对照组。
将血细胞浓度调整至1×107细胞/mL，PBS重悬，与Alexa Fluor 488标记的非特异性抗PTX3抗体（1:50稀释）4°C避光孵育30分钟。冷分选缓冲液（PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA）洗涤3次后，样品经35微米尼龙网过滤，4°C保存待分选。使用BD FACSAria III流式细胞分选仪进行分选，激发波长488 nm，喷嘴直径90 μm，压力45 psi。根据Alexa Fluor 488发射强度高于104（由活淋巴细胞FSC-H/SSC门触发）收集PTX3+细胞（纯度模式>98%）。分选后重新分析分选组分，确保靶细胞纯度超过95%，每种条件进行三次生物学重复。
使用通用病毒浓缩试剂盒纯化WSSV颗粒，纯化的病毒颗粒用SYBR绿色荧光染料4°C染色2小时，调整终浓度为107颗粒/μL。然后，向青蟹注射100 μL SYBR绿色染色的WSSV颗粒，注射后3小时避光收集血细胞。将血细胞铺于共聚焦培养皿，共聚焦显微镜观察。此外，血细胞也进行流式细胞术检测，数据使用FlowJo 10分析。
对于文库制备，使用包埋有UMI和细胞条形码的凝胶珠乳液分离单细胞。裂解后，polyA RNA与磁珠杂交进行逆转录，生成带有5'端UMI和细胞条形码的cDNA。随后，通过第二链cDNA合成、接头连接和通用扩增构建文库，富集带有细胞条形码和UMI的3'转录本。使用高灵敏度DNA芯片和Qubit测定进行定量，并在DNBSEQ-T7上测序。原始数据已上传至NCBI公共数据库。数据处理使用Cell Ranger，通过STAR与参考基因组比对。通过UMI计数和过滤非细胞条形码生成基因-条形码矩阵。使用Seurat去除低质量细胞。然后进行数据标准化、可变基因识别和多样本整合。PCA将维度降至前30个主成分，随后进行t-SNE聚类可视化。
使用基于PCA降维数据的图聚类方法（Louvain算法）对细胞进行聚类。对于亚聚类，对特定数据集应用相同的缩放降维和聚类程序。对于每个簇，使用Wilcoxon秩和检验寻找与其余簇相比显著差异表达的基因。使用SingleR和已知标记基因鉴定细胞类型。
从青蟹分离的EVs转录组由北京贝马克生物技术有限公司测序；处理组包括PBS组和WSSV组，原始数据已上传至NCBI公共数据库。经EVs-PBS、EVs-WSSV+GFP-siRNA和EVs-WSSV+wsv271-siRNA处理的青蟹血细胞转录组由广州基迪奥生物科技有限公司测序；原始数据已上传至NCBI公共数据库。
使用Origin Pro 8.0软件进行统计分析：多组比较（≥3组）采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组比较采用T检验，参考值分析采用单样本t检验；所有分析中p值<0.05认为具有统计学显著性，所有实验至少包含三次生物学重复。
3 Results
3.1 EVs通过诱导NETosis样反应抑制WSSV感染期间的病毒复制
为探索甲壳类动物的抗病毒免疫机制，构建了WSSV感染的青蟹模型。观察到WSSV感染期间青蟹血细胞核解体，这是脊椎动物NETosis的典型特征。此外，在扫描电子显微镜下观察到血细胞中存在典型的胞外诱捕网形态。考虑到EVs在先天免疫调控中的关键作用，从WSSV感染前后的青蟹中分离了EVs。通过TEM观察到从PBS注射和WSSV注射青蟹收集的EVs呈杯状结构，NTA测量了EVs的粒径和浓度，Western blot检测EVs标志物CD9、CD63、TSG101和内质网膜标志物Calnexin以确定纯度。发现单独注射EV-WSSV也能导致无WSSV感染的青蟹出现核解体和胞外诱捕网。鳃丝HE染色也显示WSSV和EV-WSSV可诱导胞外诱捕网形成。随后进行scRNA-seq以检测青蟹中是否存在中性粒细胞。在血细胞中鉴定出五种主要细胞类型：多线细胞、巨噬细胞样细胞、粒细胞、单核细胞样细胞和生殖样细胞。这些细胞类型基于特定标记基因提示的潜在功能进行注释。值得注意的是，GO和KEGG分析显示粒细胞具有中性粒细胞胞外诱捕网形成功能。因此，对粒细胞进行了亚细胞分型，根据已发表研究，使用PTX3和Crustin作为中性粒细胞样细胞的标记基因。发现WSSV感染期间中性粒细胞样细胞比例增加。然后，用PTX3抗体标记血细胞，并通过流式细胞术和共聚焦显微镜检测。结果显示，在SEM下，PTX3标记的血细胞与未标记细胞相比存在显著的形态学差异。
为确认上述NETosis现象
