《Journal of Chromatography Open》：Study on enantioselective recognition of metofoline enantiomers with cyclodextrins using capillary electrophoresis, nuclear magnetic resonance spectroscopy and molecular modeling techniques
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本研究针对弱分子间相互作用中手性识别机制尚不明确的难题，以美托福林（MF）为模型分子，结合毛细管电泳（CE）、核磁共振（NMR）和分子模拟技术，系统研究了其与β-环糊精（CD）、γ-CD及七(2,3-二-O-乙酰基)-β-CD（HDA-β-CD）的对映选择性识别。研究不仅成功解析了MF对映体的绝对构型，还揭示了由β-CD到γ-CD导致的洗脱顺序反转（EMO reversal）现象。通过NMR和QM计算，阐明了该反转源于两种CD与MF结合时主导作用力的差异：β-CD以疏水作用为主，而γ-CD则以氢键作用为主。该研究为理解手性识别机制提供了多技术联用的范例，并验证了计算工具在预测弱相互作用中的可靠性。
在药物研发和生命科学领域，手性分子的对映体（镜像分子）往往具有截然不同的生物活性、代谢途径甚至毒性。因此，高效分离和识别手性分子对映体，并深入理解其与手性选择剂之间的相互作用机制，是药物化学和分析化学领域长期以来的核心挑战。尽管分离科学（如高效液相色谱HPLC、毛细管电泳CE等）技术已经非常成熟，能够灵敏地检测到微弱的对映选择性，但这些技术本身并不能直接揭示分子间相互作用的“黑箱”——即手性选择剂与对映体之间究竟形成了怎样的空间结构，以及是哪些微小的能量差异最终导致了分离。
为了回答这些根本性问题，来自第比利斯国立大学和意大利研究团队的研究人员开展了一项综合性研究。他们选择了一个具有代表性的手性药物分子——美托福林（Metofoline, MF），以及三种常见的环糊精（Cyclodextrins, CDs）作为手性选择剂，通过将高灵敏度的毛细管电泳（CE）、能够提供溶液结构信息的核磁共振（NMR）波谱学以及能够从原子层面计算能量的分子模拟技术相结合，系统性地探究了手性识别的分子基础。这项研究不仅成功解析了MF对映体的绝对构型，还深入揭示了当环糊精的腔体尺寸从β-CD变为γ-CD时，为何会导致MF对映体洗脱顺序发生反转这一有趣现象。该研究成果发表于《Journal of Chromatography Open》杂志。
为了系统研究美托福林（MF）与环糊精（CDs）的手性识别机制，研究人员采用了多技术联用的策略。首先，他们通过手性HPLC制备了MF的对映体纯样品，并利用电子圆二色谱（ECD）结合量子力学（QM）计算，确定了MF对映体的绝对构型。随后，利用毛细管电泳（CE）评估了MF与β-CD、γ-CD及HDA-β-CD的对映选择性分离效果，并观察到了洗脱顺序的反转现象。为了阐明结合机制，研究团队运用核磁共振（NMR）技术，通过1H NMR和ROESY实验确定了主客体复合物的化学计量比、结合位点及空间构象。最后，基于NMR提供的结构信息，研究人员构建了初始复合物模型，并利用密度泛函理论（DFT）进行量子力学优化，计算了结合能，从能量角度解释了实验观察到的对映选择性差异。
3.1. HPLC fractionation of Metofoline enantiomers
研究人员首先通过手性HPLC成功分离了外消旋的美托福林（MF），并收集了纯度分别为96.2%和97.7%的两个对映体组分，为后续的绝对构型确定和CE分析提供了高纯度的样品。
3.2. Determination of absolute stereochemical configuration of metofoline enantiomers
为了确定MF对映体的绝对构型，研究人员将实验测得的ECD光谱与通过量子力学（QM）计算得到的理论光谱进行了比较。他们发现，MF分子在溶液中存在折叠和伸展两种构象，且其ECD光谱差异显著。通过使用包含色散校正的WB97XD泛函进行构象分析，能够更准确地预测构象的相对能量。最终，通过比较实验光谱与计算得到的(S)-MF的玻尔兹曼平均ECD光谱，研究人员成功地将第一个洗脱的对映体鉴定为(S)-构型。
3.3. CE separation of metofoline enantiomers
毛细管电泳（CE）分析结果显示，MF对映体在β-CD、γ-CD和HDA-β-CD三种手性选择剂下均能实现分离。值得注意的是，当使用β-CD时，洗脱顺序为(S)先于(R)；而当使用γ-CD时，洗脱顺序发生了反转，变为(R)先于(S)。同样，与β-CD相比，乙酰化衍生物HDA-β-CD也导致了洗脱顺序的反转。这种因手性选择剂微小结构变化而引起的洗脱顺序反转现象，为深入研究手性识别机制提供了绝佳的切入点。
3.4. NMR spectroscopic studies of stoichiometry and structure of metofoline/CD complexes
核磁共振（NMR）研究是揭示复合物结构的关键。通过1H NMR滴定实验，研究人员发现MF与γ-CD的相互作用较为复杂，可能存在多种复合物形式。更重要的是，通过旋转坐标系核欧沃豪斯效应谱（ROESY）实验，研究人员观察到了MF的4-氯苯基（4-chlorophenyl）环上的质子与环糊精（CD）腔内质子（H-3和H-5）之间的交叉峰，这表明MF是通过该芳香环插入到β-CD、γ-CD和HDA-β-CD的腔体内部形成包合物的。这一发现为后续的分子模拟计算提供了至关重要的结构约束。
3.5. Quantum mechanics optimization of the complexes of metofoline enantiomers with β-CD and γ-CD
基于NMR提供的结构信息，研究人员构建了MF与β-CD和γ-CD的初始复合物模型，并利用密度泛函理论（DFT）进行了量子力学优化。计算得到的结合能（Ebinding）与实验观察到的洗脱顺序完全一致。结构分析揭示了洗脱顺序反转的分子机制：对于β-CD，MF的4-氯苯基环被包合，但整个结合过程主要由疏水作用主导，对映体之间的结合能差异极小（ΔEbinding= -0.02 kcal·mol-1）。而对于γ-CD，由于其腔体更大，MF能够采取不同的构象，使得其含氮的异喹啉环能够靠近CD的宽口端，从而形成氢键。计算结果显示，(R)-MF与γ-CD形成的氢键距离更短，结合更强，这解释了为什么(R)-对映体在γ-CD存在下迁移更慢，从而导致了洗脱顺序的反转。
本研究通过将毛细管电泳（CE）、核磁共振（NMR）波谱学和量子力学（QM）分子模拟技术有机结合，系统阐明了美托福林（MF）对映体与环糊精（CDs）的手性识别机制。研究不仅成功解析了MF对映体的绝对构型，更重要的是，深入揭示了由β-CD到γ-CD导致的洗脱顺序反转（EMO reversal）现象背后的分子基础。NMR ROESY实验证实，MF主要通过其4-氯苯基环插入到所有三种CD的腔体中。然而，QM计算揭示，在β-CD中，结合主要由疏水作用主导，对映体之间的结合能差异极小；而在γ-CD中，由于腔体尺寸增大，MF能够采取不同的构象，使得其含氮的异喹啉环能够与CD的羟基形成氢键，这种氢键作用的差异是导致对映选择性反转的根本原因。该研究不仅为理解手性识别机制提供了深刻的分子层面见解，也验证了计算工具在预测和解释弱分子间相互作用中的可靠性，为未来理性设计手性选择剂提供了重要的理论依据。
