《Aging Cell》：The 3xTg-AD Mouse Model of Alzheimer's Disease Exhibits Lifelong Reductions in Circulating Choline Despite Adequate Dietary Intake, With Sex-Specific Neuropathological and Behavioral Phenotypes
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本文揭示了3xTg-AD阿尔茨海默病（AD）模型小鼠在其整个生命周期中，尽管饮食摄入充足，却存在持续的循环胆碱水平降低现象。研究通过纵向监测血浆胆碱、体重、饲料消耗，并结合IntelliCage自动化行为表型分析及神经病理学评估，证实了该模型存在显著的性别二态性：雌性小鼠呈现更严重的AD样病理负担（Aβ、p-Tau），而雄性小鼠则表现出更高的死亡率及独特的行为模式（如空间任务更优但回避测试中持续行为）。研究指出，慢性低胆碱血症可能通过影响代谢、炎症调节及神经元功能，加剧该模型的多种功能障碍，为理解AD发病机制的性别差异及胆碱营养干预提供了重要实验依据。
3xTg-AD小鼠模型中的胆碱代谢与性别二态性
1 引言
阿尔茨海默病（AD）是一种与年龄相关的神经退行性疾病，是美国65岁及以上人群中最常见的痴呆形式。女性AD患病率高于男性。AD的临床特征包括进行性记忆丧失和执行功能障碍，其病理基础是脑内淀粉样蛋白-β（Aβ）斑块和神经纤维tau缠结（NFTs）的积累、神经炎症和神经元丢失。三转基因AD小鼠（3xTg-AD）是常用的AD模型，携带家族性AD相关突变（APP Swedish, MAPT P301L, PSEN1 M146V），能模拟AD样病理和行为缺陷。然而，该模型存在显著的性别差异：雄性小鼠病理发展不一致，但更易出现衰弱和早期死亡，这与人类AD中的性别差异相似。
胆碱是一种必需营养素，对大脑和全身健康至关重要。人体所需胆碱约30%由肝脏内的磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT）内源性合成，其余70%需从膳食获取。研究表明，低循环胆碱水平与AD病理严重程度和神经炎症相关，而补充胆碱能减轻AD模型小鼠的病理。前期研究发现，7月龄的3xTg-AD雌鼠血浆胆碱水平已低于非转基因（NonTg）对照，且3xTg-AD小鼠尽管摄入更多饲料，循环胆碱水平仍较低，提示其可能存在胆碱代谢功能障碍。本研究旨在探究3xTg-AD小鼠生命周期中循环胆碱水平的性别差异是否与其病理发展差异相关。
2 材料与方法
研究使用3xTg-AD纯合子小鼠及其NonTg对照（C57BL6/129Svj背景）。在3、6、9、12月龄及终点（平均16.81月龄）测量体重、饲料消耗并采集血浆。行为测试始于约13.5月龄，包括高架十字迷宫（EPM）、转棒实验（Rotarod）和IntelliCage自动化行为测试（评估空间学习、认知灵活性、冲动性、注意力等）。终点时收取脑组织（海马HP、皮层CTX）和肝脏，通过ELISA检测不溶性Aβ40、Aβ42以及磷酸化tau（pTauT181、pTauS396）水平，通过免疫印迹分析肝脏PEMT蛋白表达。血浆胆碱水平使用商业试剂盒测定。统计方法包括t检验、方差分析（ANOVA）及重复测量ANOVA。
3 结果
3.1 3xTg-AD雄性小鼠死亡率高
3xTg-AD小鼠生存率显著低于NonTg。仅20.8%的3xTg-AD雄性和52.2%的3xTg-AD雌性存活至研究结束，而NonTg雄性和雌性的存活率分别为80.0%和87.5%。
3.2 体重与饲料消耗
从2月龄到12月龄，3xTg-AD雌性比NonTg雌性体重增加更多，而3xTg-AD雄性比NonTg雄性体重增加更少。12月龄后，雄性体重下降多于雌性。至终点时，各组体重无差异。饲料消耗分析显示，3xTg-AD雌性和NonTg雄性在不同时间点通常消耗更多饲料。
3.3 3xTg-AD小鼠终生循环胆碱水平降低
纵向分析显示，3xTg-AD小鼠的血浆胆碱水平在所有时间点均显著低于NonTg小鼠。胆碱水平随年龄增长而下降，这种年龄相关的下降在NonTg小鼠中更为明显。在3月龄时，NonTg雌性胆碱水平高于NonTg雄性。
3.4 PEMT蛋白水平存在性别差异但无基因型差异
肝脏PEMT蛋白水平在雌性小鼠中高于雄性，但3xTg-AD与NonTg之间无显著差异。PEMT蛋白水平与循环胆碱水平无显著相关性。
3.5 行为学表现
3.5.1 高架十字迷宫与转棒实验
在EPM上，3xTg-AD小鼠的开放臂进入次数和总臂进入次数均少于NonTg，表明其探索行为减少或焦虑样行为增加。在转棒实验第2天，3xTg-AD小鼠的跌落潜伏期长于NonTg，但在第3天（探测试验）各组无差异。
3.5.2 IntelliCage行为测试
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适应阶段： 所有组均能学会任务规则。雄性表现出比雌性更强的饮水寻求行为（总访问次数、舔舐次数更多）。
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位置偏好（PP）与逆转： 所有组在PP和逆转任务中的正确反应百分比（%Correct responses）均随天数增加而提高，显示学习能力。雄性在任务参与度（总访问次数、指定访问次数）上高于雌性。
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反应时间（RT）任务： 在所有RT任务变体中（不同预提示延迟和提示持续时间），3xTg-AD小鼠表现出比NonTg更高的冲动性（%Premature responses更高）和更低的正确率（%Correct responses更低）。雄性小鼠在多个任务中发起的试验次数多于雌性，并且在某些任务变体（如可变预提示延迟/1秒提示）中正确率高于雌性。
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位置回避与消退： 在回避训练中，雄性对空气喷射角的访问次数多于雌性，3xTg-AD雌性访问次数最少。在消退阶段，雄性表现出更强的饮水寻求行为。
3.6 神经病理学
在3xTg-AD小鼠中，雌性表现出比雄性显著更高的AD样病理负担：海马和皮层内的不溶性Aβ40、Aβ42水平更高；磷酸化tau（pTauT181和pTauS396）水平也更高。NonTg小鼠脑组织未检测到上述病理蛋白。
4 讨论
本研究证实3xTg-AD小鼠在整个生命周期中存在持续的低循环胆碱血症，且这种降低与饮食摄入量或肝脏PEMT蛋白水平无关。研究结果突出了该模型显著的性别二态性：3xTg-AD雌性小鼠表现出更严重的AD典型神经病理（Aβ、tau），而3xTg-AD雄性小鼠则表现为更高的死亡率、更明显的体重下降（尤其在行为测试后）以及独特的行为模式（如空间和注意力任务表现相对较好，但冲动性增加，且在回避任务中表现出持续性行为）。胆碱水平的性别差异不能完全解释病理差异，因为3xTg-AD雌性摄入更多胆碱且PEMT水平更高。慢性低胆碱血症可能通过影响代谢、加剧炎症等方式，分别贡献于雌性的神经病理和雄性的外周功能障碍及脆弱性。普遍表达的PSEN1 M146V敲入突变可能导致全身性功能障碍，其在雄性中可能通过加剧外周病理（如肝脏炎症、免疫激活）影响生存，而在雌性中则更直接地驱动脑内病理。行为学上，IntelliCage揭示了性别和基因型在动机、学习、冲动和回避行为上的复杂相互作用。总之，尽管摄入推荐量胆碱，3xTg-AD小鼠仍存在终生循环胆碱不足，提示其胆碱需求可能高于正常水平，这为AD发病机制的性别差异提供了新见解，并强调了考虑个体化胆碱营养策略的潜在重要性。
