《Cancer Science》：Precision Oncology for Pediatric Solid Tumors Using In-Hospital Pediatric/AYA Malignancy-Specific Panel Sequencing
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本刊推荐：本研究评估了针对儿童/青少年（AYA）恶性肿瘤的院内特异性测序面板（Oncomine Childhood Cancer Research Assay）的临床效用。研究在81.8%的样本中鉴定出可报告变异，其中33.1%的样本包含具有临床意义的变异，涵盖诊断（13.9%）、预后（9%）、靶向治疗（21.9%）及耐药（9.6%）等多个层面。结果表明，该方案能在短周转时间（TAT）内实现高精度诊断、风险分层及治疗选择，为罕见且进展迅速的儿童/AYA实体瘤的精准医疗提供了高效、实用的院内解决方案。
引言
癌症管理日益依赖于肿瘤的基因组图谱，这一策略被称为“精准肿瘤学”。对于儿童和青少年及年轻成人（AYA）恶性肿瘤而言，精准肿瘤学被认为具有重要价值。与成人恶性肿瘤不同，大多数儿童和AYA恶性肿瘤起源于胚胎或神经外胚层，包含神经母细胞瘤（NB）、肝母细胞瘤（HB）和肉瘤（SAR）等多种罕见肿瘤，由于其多为小圆细胞肿瘤，仅凭常规病理学检查往往难以确诊。利用基因检测面板识别基因组改变有助于明确诊断、进行恶性肿瘤分级并找到有效治疗方案。然而，针对成人恶性肿瘤设计的面板有时并不适用于儿童和AYA恶性肿瘤，因为后者的基因组改变与成人癌症存在显著差异。此外，从送检面板到获得结果的周转时间（TAT）可能超过一个月，这对于进展迅速的儿童和AYA恶性肿瘤而言可能并不合适。因此，本研究旨在评估使用专门为儿童和AYA恶性肿瘤定制的测序面板进行院内分子谱分析的效用，以实现快速诊断和预后预测。
方法
患者与样本
研究共纳入165名儿童和AYA患者的187份样本。患者平均年龄为7岁5个月，样本包括初诊时（141份）、治疗后（12份）以及复发/难治时（34份）采集的样本。肿瘤类型涵盖80例HB、27例SAR、24例脑肿瘤（BT）、20例NB、13例肾肿瘤（RT）、12例恶性淋巴瘤（ML）、9例生殖细胞肿瘤（GCT）、1例肺母细胞瘤（PPB）和1例恶性外周神经鞘瘤（MPNST）。对12名患者在不同时间点的样本进行了分子谱变化评估。
DNA与RNA提取及cDNA合成
从冷冻样本中提取DNA采用蛋白酶K消化后苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀的方法。RNA提取使用miRNeasy Mini Kit。从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中提取DNA和RNA则使用RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit。cDNA合成使用SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit。
文库制备与测序
采用Oncomine Childhood Cancer Research Assay进行检测，该面板可分析126个基因的突变、24个基因的拷贝数变异（CNV）和90个基因的融合，总计覆盖203个独特基因。使用Ion Chef系统进行文库制备和模板制备，并在Ion GeneStudio S5系统上使用Ion 540芯片进行测序。使用IonReporter进行变异调用，并通过COSMIC、ClinVar和OncoKB等数据库进行注释。证据等级基于OncoKB标准进行划分。通路分析基于KEGG通路数据库。
CTNNB1缺失和MYCN扩增的验证
通过电泳和Sanger测序验证CTNNB1缺失，通过荧光原位杂交（FISH）和定量PCR验证MYCN扩增。
结果
可报告变异概览
在153份样本（81.8%）中共鉴定出320个可报告变异，包括263个突变、28个CNV和29个融合。其中，75个和210个变异分别被OncoKB和COSMIC注释为“致癌”和“可能致癌”。在62份样本（33.1%）中鉴定出115个具有临床意义的变异，包括26份样本中的29个诊断性变异（13.9%）、17份样本中的17个预后性变异（9%）、41份样本中的51个可靶向变异（21.9%）以及18份样本中的18个耐药性变异（9.6%）。诊断和预后变异中分别有62.0%和94.1%具有高证据等级。最常见的受影响分子通路是染色质重塑相关通路（20.3%）、Notch信号通路（20.3%）和Wnt信号通路（15.6%）。从样本采集到分子谱报告的TAT控制在7个工作日内。
具有临床意义的变异
诊断性变异
共鉴定出29个诊断性变异，其中18个为证据等级1，2个为证据等级2，其余为证据等级3。这些变异见于SAR、BT或ML患者。证据等级1的变异包括尤文肉瘤中的EWSR1::FLI1和EWSR1::ERG融合、肺泡状横纹肌肉瘤中的PAX3::FOXO1融合、星形细胞瘤中的IDH1突变、胶质母细胞瘤和弥漫性中线胶质瘤中的H3-3A突变、低级别胶质瘤中的KIAA1549::BRAF融合、非典型畸胎样/横纹肌样瘤中的SMARCB1突变、间变性大细胞淋巴瘤中的NPM1::ALK融合以及NK母细胞淋巴瘤中的NUP214::ABL1融合。这些融合的检测直接影响组织病理学分类，在形态学和免疫组化 alone 不足的情况下实现明确诊断。
预后性变异
共鉴定出17个预后性变异，其中16个为证据等级1，1个为证据等级2。证据等级1的变异包括肺泡状横纹肌肉瘤中的PAX3::FOXO1融合、神经母细胞瘤中的MYCN扩增以及NK母细胞淋巴瘤中的NUP214::ABL1融合。证据等级2的变异为弥漫性中线胶质瘤中的H3-3A突变。
可靶向变异
共鉴定出51个可靶向变异，其中15个为证据等级1，5个为证据等级3A，31个为证据等级4。ARID1A是改变最频繁的基因（证据等级4）。证据等级1的变异包括纤维肉瘤中的TPM3::NTRK1融合、低级别胶质瘤、多形性黄色星形细胞瘤、Wilms瘤和肾细胞癌中的BRAF p.V600E突变、低级别胶质瘤中的KIAA1549::BRAF融合、星形细胞瘤和胶质母细胞瘤中的IDH1 p.R132H突变、低级别胶质瘤中的AKAP13::NTRK3融合、间变性大细胞淋巴瘤中的NPM1::ALK融合以及MPNST中的NF1突变。证据等级3A的变异为神经母细胞瘤中的ALK p.F1174L突变。
突变细节与肿瘤易感综合征
在报告性突变中，有102个单核苷酸变异（SNV）、1个多核苷酸变异（MNV）、160个插入缺失（InDel）和28个CNV。NOTCH1是最常发生改变的基因（22.3%），其次是CTNNB1（11.6%）和TP53（8.2%）。在5名患有肿瘤易感综合征的患者中验证了种系突变，包括李-佛美尼综合征患者的TP53突变、家族性腺瘤性息肉病（FAP）患者的APC突变和1型神经纤维瘤病患者的NF1突变。
融合基因细节
共鉴定出29个融合。其中，HMGA2相关融合最为常见，尤其是在各种儿童恶性肿瘤中发现的HMGA2::CHMP1A融合。EWSR1相关融合主要见于尤文肉瘤和促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤，具有诊断价值。PAX3::FOXO1融合在横纹肌肉瘤中也常见，具有预后价值。
不同时间点分子谱的获得性改变
对12名患者在不同时间点的分子谱变化评估发现，在复发的NB和SAR病例中获得了新的可靶向变异。例如，在NB-6r中获得了ALK p.F1174L和PTEN p.T131Nfs49突变；在SAR-9r中获得了ARID1A p.N2109Qfs41突变。在复发的HB和继发性胶质母细胞瘤中发现了癌基因扩增（如MDM4、PIK3CA和FGFR1扩增）的获得，这些改变可能与疾病进展和治疗耐药相关。
讨论
本研究使用针对儿童和AYA恶性肿瘤优化的院内测序面板，在81.8%的样本中鉴定出可报告变异，这一比例与之前包含更全面分子分析的研究相当甚至更高。其中，33.1%的样本含有临床意义变异，且诊断和预后变异的证据等级较高，这有助于实现明确诊断、恶性肿瘤分级和治疗选择。与成人癌症相比，儿童和AYA恶性肿瘤中存在更多与诊断和风险分层直接相关的临床意义融合，院内特异性面板测序在此显示出独特的临床价值。
本研究鉴定出的可靶向变异存在于20.8%的样本中，但许多证据等级较低，反映了儿童恶性肿瘤中高水平证据的分子靶向疗法可用性有限。未来的临床试验需要基于分子谱分析来扩展治疗选择。
与需要多种检测方法（如全外显子组测序结合RNA测序）的综合分子谱分析研究相比，本研究采用的单一集成工作流程（Oncomine Childhood Cancer Research Assay结合自动化系统）在保持高检测率的同时，降低了操作复杂性、成本和工作量，更适用于常规临床实践。
本研究提供的生物学见解显示，染色质重塑相关通路是最常受影响的分子过程，靶向该通路可能是儿童恶性肿瘤的一种有前景的治疗策略。研究还揭示了HMGA2相关融合在多种儿童恶性肿瘤中的意外存在。
纵向分子分析为了解肿瘤演变和异质性提供了视角，并可能为标准治疗无效的患者发现新的治疗机会。
研究的局限性包括其回顾性性质，以及该检测面板无法有效检测大的CTNNB1缺失（这在HB中很常见），提示可能需要长读长测序等补充方法来实现更全面的精准肿瘤学。
结论
总之，针对儿童和AYA恶性肿瘤优化的院内面板测序通过以短TAT检测精确的诊断、预后和可靶向改变，具有显著的临床影响力，并为儿童恶性肿瘤的肿瘤生物学提供了见解。尽管存在挑战，该检测方案有望为儿童和AYA患者的成功癌症治疗做出贡献。
