《Journal of Neuroimmunology》：The potential role of S-nitrosoglutathione reductase in astrocyte BAFF expression and B cell activation in experimental autoimmune encephalomyelitis
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脊髓中星形胶质细胞BAFF表达上调与B细胞浸润及IFNγ/TNFα诱导的炎症相关，抑制GSNOR（如N6022）可降低BAFF表达和B细胞积累，并通过抑制STAT1/NF-κB减少IL-6产生。
Jeseong Won | Judong Kim | S.M. Touhidul Islam | Fei Qiao | Avtar K. Singh | Inderjit Singh
美国南卡罗来纳医科大学病理学与实验室医学系，查尔斯顿，SC。
摘要
B细胞激活因子（BAFF）是B细胞驱动的自身免疫病理的关键介质。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型中，我们观察到脊髓内B细胞显著积聚，同时BAFF表达升高，尤其是在位于软脑膜下的GFAP+激活的星形胶质细胞中。BAFF的这种上调与CD4+ T细胞的浸润同时发生，尤其是产生IFNγ的Th1细胞，而IFNγ是一种对诱导星形胶质细胞中BAFF基因表达至关重要的细胞因子。此外，EAE小鼠脊髓中BAFF水平的升高与S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）还原酶（GSNOR）表达的增加相关，GSNO是一种具有抗炎特性的分子。使用可逆抑制剂N6022对GSNOR进行药理抑制可显著降低BAFF表达并减少中枢神经系统（CNS）中的B细胞积聚。体外实验表明，GSNO和N6022通过抑制STAT1和NF-κB的激活来抑制培养的星形胶质细胞中由IFNγ和TNFα诱导的BAFF表达。此外，将B细胞与IFNγ/TNFα刺激的星形胶质细胞共培养或暴露于其条件培养基中，会导致B细胞数量增加和IL-6产生增强。这些效应可以通过预先用GSNO处理星形胶质细胞或用BAFF中和抗体处理B细胞来减弱。总体而言，这些发现表明GSNOR调节星形胶质细胞中的BAFF表达，从而影响EAE中的B细胞激活及其IL-6介导的功能。调节这一通路可能为未来研究多发性硬化症（MS）及相关自身免疫疾病的免疫调节提供新的途径。
引言
多发性硬化症（MS）是一种无法治愈的致残性自身免疫疾病。长期以来，基于主要组织相容性复合体II型（MHC-II）是MS最强遗传风险因素的发现（Sospedra, 2018），以及Th1和Th17细胞在MS炎症性脱髓鞘中的作用及其动物模型（实验性自身免疫性脑脊髓炎；EAE）（Kaskow和Baecher-Allan, 2018），以及无法在T细胞缺陷小鼠中诱导EAE（Wolf等人, 1996），MS一直被认为是一种T细胞介导的疾病。然而，最近越来越多的证据表明B细胞也是MS发病机制中的活跃参与者（Hauser等人, 2008; Montalban等人, 2017）。已知B细胞通过自身抗原呈递（Li等人, 2015）、自身抗体产生（Genain等人, 1999; Storch等人, 1998）和促炎细胞因子的产生来促进炎症（Matsushita, 2019; Bao和Cao, 2014）在MS中起致病作用。B细胞在MS的进展形式中也更为活跃，它们在脑膜或血管周围区域形成异位淋巴滤泡（ELFs），从而在中枢神经系统（CNS）内局部产生自身反应性B/T细胞（Zhan等人, 2021）。
BAFF（肿瘤坏死因子家族的B淋巴细胞激活因子）对B细胞的存活、分化和免疫球蛋白的产生至关重要（Moisini和Davidson, 2009），同时也对次级淋巴器官和ELFs中的滤泡形成起作用（Collison, 2017）。它与APRIL（一种促进增殖的配体）通过共同的受体如BCMA（B细胞成熟抗原）和TACI（跨膜激活剂和钙调节剂及环磷脂酰蛋白配体相互作用蛋白）具有功能相似性（Bossen和Schneider, 2006; Schneider等人, 1999; Hahne等人, 1998; Kelly等人, 2000; Laabi等人, 1994; von Bulow和Bram, 1997）。然而，BAFF和APRIL在B细胞生物学中扮演不同的角色，因为只有BAFF能结合到B细胞上的BAFF受体（BAFFR）（Kampa等人, 2020）。研究表明，在EAE和接触超敏反应模型中，APRIL在体内激活产生IL-10的调节性B细胞中起关键作用（Fehres等人, 2019）。另一方面，BAFF水平的升高与狼疮、关节炎和干燥综合征的自身免疫发病机制密切相关（Moisini和Davidson, 2009）。因此，已经评估了包括单克隆抗体（mAb）和诱饵受体在内的抗BAFF制剂用于治疗自身免疫性疾病。通过静脉或皮下途径全身给予抗BAFF mAb已被批准用于系统性红斑狼疮。然而，不幸的是，使用全身（皮下）抗BAFF mAb治疗MS的临床试验未能达到主要终点，原因尚不清楚（Silk和Nantz, 2018）。
MS患者的血液和脑脊液中都检测到BAFF水平升高（Ragheb等人, 2011）。在MS患者的脑部，活跃炎症和脱髓鞘病变区域观察到BAFF的表达和积聚，其中星形胶质细胞主要表达BAFF，并与表达BAFF受体的B细胞共定位（Krumbholz等人, 2005）。通常，治疗性抗体或诱饵受体进入CNS的能力受到严重限制（大约只有循环量的0.1%）（Freskgard和Urich, 2017）。因此，全身（皮下或静脉）抗BAFF mAb治疗MS无效可能是因为其无法有效到达CNS的局部炎症部位。同时，目前尚不清楚抑制局部（CNS）BAFF是否会对复发缓解型MS（RR-MS）产生治疗效果。
一氧化氮（NO）在炎症过程中具有双重作用，根据其生化命运可发挥免疫调节和病理作用。虽然NO可以通过诱导抑制Th17介导的炎症的Treg细胞来促进免疫耐受（Niedbala等人, 2007; Niedbala等人, 2013），但它与超氧阴离子的相互作用会产生过氧亚硝酸盐，这是一种强效的氧化和硝化应激物质，与MS病理有关（Witherick等人, 2010）。S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）是一种生物性的NO载体分子，通过与还原型谷胱甘肽（GSH）反应形成，提供了一种可控的调节NO信号传导的方式，而不会自发产生过氧亚硝酸盐（Gaston等人, 2003）。相反，GSNO促进了参与免疫和炎症反应的靶标信号成分的翻译后修饰（S-亚硝基化，例如NF-κB（Marshall等人, 2004; Kelleher等人, 2007; delaTorre等人, 1998）和STAT3（Kim等人, 2013）），并激活对细胞稳态至关重要的cGMP介导的通路（Gaston等人, 2003）。
我们的实验室已经证明，GSNO介导的S-亚硝基化机制在控制EAE模型中的自身免疫性脱髓鞘中起作用。我们之前报告称，EAE小鼠脊髓中GSNO代谢酶GSNO还原酶（GSNOR）的表达和活性增加，使用可逆抑制剂（如N6022和N91115）药理抑制GSNOR或通过基因删除GSNOR可以缓解EAE疾病（Prasad等人, 2007; Saxena等人, 2018; Singh等人, 2018; Singh等人, 2018; Nath等人, 2010）。
本研究旨在验证抑制调节细胞内S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）水平的GSNOR可以抑制星形胶质细胞来源的BAFF表达并调节CNS中的B细胞驱动的免疫反应。我们的目标是：（i）描述EAE进展过程中脊髓中BAFF表达和免疫细胞浸润的时间动态；（ii）确定GSNO和GSNOR抑制剂N6022是否在体内和体外影响星形胶质细胞中的BAFF表达；（iii）评估其对B细胞积聚和效应功能的下游影响。
在这里，我们证明了星形胶质细胞是EAE模型脊髓中BAFF的主要来源之一，而使用N6022进行全身GSNOR抑制可以减少其表达。体外实验中，无论是通过与B细胞直接共培养还是通过激活星形胶质细胞的条件培养基，星形胶质细胞来源的BAFF都会增加B细胞数量并促进IL-6的产生。这些效应可以通过GSNO处理来减弱，这表明通过提高内源性GSNO水平或抑制GSNOR可能有助于通过限制BAFF表达来抑制自身免疫炎症。这些发现突显了GSNOR在调节EAE和MS中星形胶质细胞BAFF表达和B细胞激活中的作用。鉴于全身抗BAFF疗法对CNS的有限作用，GSNO/GSNOR轴可能成为调节CNS内BAFF水平的潜在机制。这些发现值得进一步研究，以评估其在MS中B细胞介导的CNS炎症中的相关性。
动物、活性EAE的诱导和药物治疗
C57BL/6和转基因C57BL/6-Tg (Tcra2D2, Tcrb2D2)1Kuch/J小鼠（通常称为TCRMOG或2D2）从Jackson实验室（美国缅因州Bar Harbor）获得。所有动物都被饲养在南卡罗来纳医科大学的无病原体设施中，在整个研究期间可以自由获取食物和水。所有实验程序均遵循人道对待和实验室动物使用的指南，并得到了机构动物委员会的批准。
MOG35–55诱导的EAE中C57BL/6小鼠脊髓中的免疫细胞动态和BAFF表达
为了描述EAE期间CNS中免疫细胞浸润及相关分子反应的时间动态，我们检查了MOG35–55免疫的C57BL/6 EAE小鼠（MOG35–55-B6 EAE模型）脊髓中的CD4+ T细胞和B细胞浸润，以及BAFF和相关炎症介质的表达。
在疾病过程中，我们观察到CD4+ T细胞早在无症状阶段（免疫后第7天）就开始浸润脊髓。
讨论
现在已明确，B细胞不仅通过产生自身抗体，还通过向T细胞呈递自身抗原和分泌促炎细胞因子（如IL-6、IFN-γ和GM-CSF）来参与MS的发病机制（Matsushita, 2019; Wilson, 2012）。在这些细胞因子中，IL-6在MS发病机制中尤为重要，因为MS患者的B细胞已被证明会分泌高水平的IL-6，而B细胞特异性IL-6缺失的小鼠则不会发展出MS（
结论
总体而言，这项研究强调了星形胶质细胞来源的BAFF作为调节CNS内B细胞积聚及其效应功能的关键调节因子的重要性，这两者都促进了MS中的自身免疫炎症的持续。我们的发现进一步表明，药理抑制GSNOR可以有效抑制星形胶质细胞中的BAFF表达，从而减轻B细胞驱动的神经炎症。针对这一通路可能有助于调节MS中的免疫反应。
CRediT作者贡献声明
Jeseong Won：写作 – 审稿与编辑，撰写原始草稿，可视化，验证，监督，软件使用，资源管理，项目管理，方法学，研究设计，数据分析，概念化。
Judong Kim：方法学，数据分析。
S.M. Touhidul Islam：方法学，数据分析。
Fei Qiao：方法学。
Avtar K. Singh：写作 – 审稿与编辑，方法学。
Inderjit Singh：写作 – 审稿与编辑，监督，资金获取，数据分析。
伦理批准
所有涉及动物处理和护理的实验均获得了南卡罗来纳医科大学IACUC的批准。
资助
这项工作部分得到了美国退伍军人事务部（U.S. Department of Veterans Affairs）的支持（BX002829）。
利益冲突声明
作者声明，本研究未涉及任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系。
