基于PEDV S蛋白间接ELISA法的建立及其与中和抗体和免疫保护的相关性评估

《Transboundary and Emerging Diseases》：Development of an Indirect ELISA Based on the PEDV S Protein and Evaluation of Its Correlation With Neutralizing Antibody and Immune Protection

本综述系统阐述了基于CHO细胞表达的重组猪流行性腹泻病毒（PEDV）刺突（S）蛋白建立间接ELISA（iELISA）方法的开发与优化过程。研究证实该方法具有高特异性（与PDCoV、TGEV等常见猪病毒无交叉反应）和灵敏度（CV<6.30%），且检测的IgG水平与病毒中和（VN）抗体滴度显著相关（r=0.95），为评估疫苗免疫后保护性抗体水平及群体免疫状态提供了可靠工具。

引言

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的高度传染性肠道疾病，尤其对7日龄内仔猪致死率可达100%。PEDV属于α冠状病毒属，其基因组编码的结构蛋白中刺突（S）蛋白是介导病毒入侵的关键抗原，也是疫苗研发和血清学检测的主要靶标。通过监测母猪血清PEDV特异性IgG水平，可评估疫苗免疫效果并预测仔猪保护率。

结果与讨论

本研究利用CHO细胞表达系统重组表达了PEDV CH/HNDZ/2022毒株（GIIc基因型）的S蛋白，通过棋盘滴定法优化了iELISA反应条件：抗原包被浓度1 μg/mL、血清稀释度1:300、二抗稀释度1:60,000时阳性/阴性（P/N）比值最高。采用2%牛血清白蛋白（BSA）封闭180分钟，血清孵育30分钟、二抗孵育60分钟、底物反应15分钟可获得最佳信噪比。

通过检测50份阴性血清确定诊断临界值（cutoff）为0.796（均值+3SD）。特异性验证显示，与猪δ冠状病毒（PDCoV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、A组轮状病毒（PoRVA）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及非洲猪瘟病毒（ASFV）阳性血清均无交叉反应。批间变异系数（CV）为1.2%–6.3%，91.7%样本CV≤5%，表明方法具有良好重复性。与商品化ELISA试剂盒比较显示，本研究建立的iELISA对部分样本检测灵敏度更高（如样本5的终点滴度为1:4800 vs 商品化试剂盒1:2400），临床符合率达94.18%。

通过免疫4周龄仔猪发现，二次免疫后2–3周IgG滴度达峰值，可持续12周以上。iELISA检测的IgG水平与病毒中和（VN）抗体滴度呈强相关（r=0.95）。在暴发PEDV的猪场中，妊娠母猪产前5周和3周接种灭活疫苗后，母源血清VN抗体滴度与仔猪21日存活率相关性最高（r=0.89），IgG水平也与存活率显著相关（r=0.85），证实iELISA可作为评估保护性免疫的有效替代指标。

材料与方法

实验采用CHO细胞表达的全长S蛋白（C端带His₆标签），经镍柱亲和层析和分子筛纯化，纯度>95%。iELISA操作流程包括碳酸盐缓冲液（pH 9.6）包被、BSA封闭、血清孵育、HRP标记兔抗猪IgG二抗反应及TMB显色。临界值基于50份阴性血清的S/P比值（样本OD₄₅₀– 阴性对照OD₄₅₀）/（阳性对照OD₄₅₀– 阴性对照OD₄₅₀）设定。病毒中和试验采用200 TCID₅₀PEDV与系列稀释血清孵育后感染Vero细胞，观察细胞病变效应（CPE）计算NT₅₀。统计学分析使用GraphPad Prism 8，相关性采用Pearson检验。

结论

本研究建立的基于CHO表达PEDV S蛋白的iELISA法具有高特异性、灵敏度和重复性，其检测结果与中和抗体滴度及仔猪保护率高度一致，为规模化猪场疫苗免疫效果评估和群体抗体监测提供了可靠技术支撑。