《Cell Death & Disease》：CCL20 secreted by KRT15high tumor Cells promotes tertiary lymphoid structure formation and enhances anti-PD-1 therapy response in HPV+HNSCC
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本研究针对HPV阳性头颈鳞癌（HNSCC）患者对免疫检查点疗法（ICT）反应更佳的临床现象，深入探讨了三级淋巴结构（TLS）形成的机制。研究人员发现HPV感染通过上调肿瘤细胞中KRT15的表达，使其具备干细胞样特性并特异性分泌CCL20，进而招募免疫细胞促进成熟TLS形成。该TLS微环境支持CD39+PD-1+CD-1+CD8+T细胞增殖，最终增强抗PD-1治疗效果。这项研究为HPV+HNSCC的精准免疫治疗提供了新的生物标志物和潜在靶点。
在头颈鳞癌（HNSCC）的治疗领域，免疫检查点疗法（ICT）虽然为复发或转移性患者带来了一线生机，但一个令人困惑的临床现象始终萦绕在研究人员心头：为什么人乳头瘤病毒（HPV）阳性的HNSCC患者通常表现出更好的预后和对ICT更佳的治疗反应？这种差异背后的分子机制至今尚未明确。与此同时，肿瘤微环境（TME）中一种被称为三级淋巴结构（TLS）的“免疫堡垒”逐渐成为研究热点。这些结构类似于次级淋巴器官，能够促进抗原呈递、招募效应免疫细胞，并支持肿瘤特异性抗体的产生，从而增强抗肿瘤免疫力。成熟TLS的存在已被证实与多种癌症的免疫治疗良好反应相关，包括HNSCC。然而，HPV感染是否以及如何影响TLS的形成，进而调控免疫治疗效果，仍然是一个未解之谜。
为了回答这些问题，来自深圳市第三人民医院、南方科技大学第二附属医院等机构的研究团队开展了一项多组学整合研究。他们发现HPV阳性HNSCC中成熟TLS的形成频率显著高于HPV阴性病例，并揭示了一群表达KRT15的肿瘤细胞在其中的关键作用。这些KRT15high的肿瘤细胞具有干细胞样特性，并能特异性分泌趋化因子CCL20，从而驱动TLS的组装。更为重要的是，动物实验证实，外源性CCL20处理能够促进TLS形成，并显著增强抗PD-1疗法的抗肿瘤效果。这项开创性的研究成果发表在《Cell Death & Disease》期刊上，不仅阐明了HPV阳性HNSCC免疫治疗优势的部分机制，也为开发新的联合免疫治疗策略提供了理论依据。
本研究综合运用了多种前沿技术手段。研究人员收集了59例HNSCC患者的临床组织样本进行免疫组化（IHC）分析。他们利用来自TCGA（The Cancer Genome Atlas）的518例HNSCC患者的RNA测序（RNA-seq）数据、来自GEO（Gene Expression Omnibus）数据库的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE139324, GSE164690）进行生物信息学分析。此外，还对4例HNSCC患者（2例HPV阳性，2例HPV阴性）的肿瘤组织进行了10x Genomics Visium空间转录组学（ST）测序。在实验验证方面，研究团队使用了人源（Cal27, SCC47）和小鼠源（MOC1）HNSCC细胞系，通过质粒转染构建了稳定表达HPV16 E5、E6、E7癌基因的细胞模型，并建立了小鼠HNSCC移植瘤模型进行体内功能验证。统计分析采用GraphPad Prism 6软件，包括Mann-Whitney检验、Student‘s t检验、单因素方差分析（ANOVA）等。
研究结果
1. HPV阳性HNSCC中成熟TLS高发且与良好预后相关
通过对59例HNSCC组织样本的分析，研究人员发现HPV阳性患者中成熟TLS（以存在滤泡树突状细胞网络为标志）的检出率显著高于HPV阴性患者。空间转录组学分析能够清晰区分肿瘤组织中的不同病理区域（如肿瘤核心区、基质区、TLS区）。研究人员通过差异基因表达分析和空间相关性分析，定义了一个包含10个基因（如CD22, PAX5等）的成熟TLS转录特征集。应用该特征集对TCGA数据库中518例HNSCC患者进行分析，结果显示高TLS评分与患者更好的总生存期显著相关。值得注意的是，即使在TLS阳性的患者亚群中，HPV阳性患者的预后依然优于HPV阴性患者，提示HPV感染可能通过TLS依赖和非依赖的双重途径改善预后。
2. KRT15high肿瘤细胞是TLS阳性HNSCC的特征性细胞群
对TCGA数据的聚类分析将HNSCC患者分为5个亚群，其中Group 4富含HPV阳性患者，且表现出高水平的CD8+T细胞浸润、NF-κB信号通路激活和高TLS评分，预后最佳。该组患者肿瘤细胞中KRT15、KRT19、UBD等基因表达显著上调。单细胞RNA测序分析进一步揭示，KRT15和KRT19特异性地高表达于肿瘤细胞，尤其是在HPV阳性HNSCC中。生存分析表明，高表达KRT15与HPV阳性HNSCC患者的良好预后正相关，但在HPV阴性患者中无此关联。免疫组化和体外细胞实验均证实KRT15在HPV阳性HNSCC组织和细胞系中表达上调。机制上，HPV16 E6癌基因的导入是驱动KRT15表达升高的关键因素。此外，KRT15high肿瘤细胞高表达ALDH2、SOX2等干细胞标志物，显示出癌症干细胞特性。这些细胞在HPV阳性HNSCC中比例更高，并且其基因表达谱与免疫细胞浸润和TLS存在正相关。
3. KRT15high肿瘤细胞来源的CCL20与TLS形成密切相关
单细胞测序和空间转录组分析发现，在HPV阳性HNSCC中，CCL20主要由KRT15high肿瘤细胞分泌，并且其表达在TLS周围的肿瘤区域尤为富集。而在HPV阴性HNSCC中，CCL20的主要来源是髓系细胞。TCGA数据分析显示CCL20在HPV阳性HNSCC中表达更高，且其表达量与KRT15水平、多种TLS相关免疫细胞（B细胞、CD8+T细胞、树突状细胞）的浸润程度呈正相关，并与HPV阳性患者的良好预后相关。细胞实验表明，HPV16 E6和E7癌基因能上调CCL20的表达。这些结果提示，在HPV阳性HNSCC中，KRT15high肿瘤细胞通过分泌CCL20，在招募免疫细胞、促进TLS形成中扮演了核心角色。
4. CCL20促进TLS形成并增强抗PD-1疗效
为了验证CCL20的体内功能，研究人员利用MOC1细胞构建了小鼠HNSCC模型。局部注射重组CCL20蛋白后，肿瘤内CD4+T细胞和CD19+B细胞的浸润显著增加，并出现了这些细胞的共定位聚集，这是TLS形成的早期标志。在肿瘤接种第10天开始联合抗PD-1治疗，结果显示，虽然单独使用CCL20或抗PD-1抗体对肿瘤生长的抑制效果有限，但CCL20预处理能显著增强后续抗PD-1疗法的疗效。联合治疗组小鼠肿瘤内可见成熟的TLS结构，其特征是CD21+树突状细胞、CD4+T细胞和CD19+B细胞的高度有序共定位。这表明CCL20诱导的TLS为抗PD-1疗法发挥效力创造了有利的局部免疫微环境。
5. TLS支持PD-1+CD8+T细胞增殖
对CD8+T细胞的单细胞测序分析将其分为9个亚群，其中包括多个表达耗竭标志（如LAG3, TIGIT）的PD-1+亚群。空间转录组和免疫荧光分析证实PD-1+CD8+T细胞在TLS区域内高度富集。特别值得注意的是，研究人员发现了一个同时表达PD-1和CD39（ENTPD1）的CD8+T细胞亚群，该亚群还高表达增殖标志MKI67，并且主要定位于TLS内部。CD39被认为是肿瘤反应性CD8+T细胞的标志物。进一步分析显示，TLS区域内抗原呈递相关通路基因表达上调，细胞间通讯分析也提示TLS内存在活跃的抗原呈递信号。多重免疫荧光结果直观显示，增殖的（MKI67+）CD8+T细胞与树突状细胞、CD4+T细胞在TLS内存在紧密接触。这表明TLS提供了一个独特的微环境，通过有效的抗原呈递和支持性信号，促进了具有抗肿瘤潜能的PD-1+CD8+T细胞的克隆性增殖和功能维持。
结论与意义
本研究系统地阐明了HPV阳性头颈鳞癌中一条新的免疫调控轴：HPV感染（主要通过E6癌基因）驱动肿瘤细胞表达KRT15，使其获得干细胞样特性；这些KRT15high肿瘤细胞特异性分泌趋化因子CCL20，进而招募淋巴细胞并在肿瘤局部促进三级淋巴结构（TLS）的组装和成熟；所形成的TLS微环境为CD39+PD-1+CD8+T细胞等关键抗肿瘤效应细胞的增殖和功能发挥提供了理想场所，最终显著增强了对PD-1阻断疗法的敏感性。
该研究的创新之处在于首次将HPV感染、肿瘤细胞固有特征（KRT15表达）、趋化因子分泌（CCL20）、TLS形成和免疫治疗疗效有机地串联起来，揭示了肿瘤细胞本身在塑造抗肿瘤免疫微环境中的主动作用。这不仅为理解HPV阳性HNSCC更好的临床预后提供了机制解释，也提出了KRT15和CCL20作为预测免疫治疗疗效的潜在生物标志物。更重要的是，研究通过动物模型证实了外源性CCL20联合抗PD-1治疗的可行性，为开发新的联合免疫治疗策略（例如，通过局部递送CCL20或其激动剂来“原位”诱导TLS）奠定了坚实的理论基础，具有重要的临床转化价值。
