《APMIS》：Understanding Heterogeneity and Tolerance of Dual Candida albicans–Staphylococcus aureus Biofilms to Cold Atmospheric Plasma and Antimicrobial Combinations
1 引言
白色念珠菌和金黄色葡萄球菌形成的跨界双菌种生物膜是临床上面临的重大挑战，通常会加剧感染严重程度并使治疗复杂化。这两种微生物经常在血流感染、囊性纤维化（CF）患者痰液以及越来越多的骨髓炎病例中被共同分离出来。生物膜内的协同相互作用促进了致病性和抗菌耐受性。菌丝关联促进了金黄色葡萄球菌的黏膜渗透和全身传播，同时使白色念珠菌转向更具毒力的状态，上调关键生物膜和毒力基因，如HSP90和ACE2。白色念珠菌的生物膜结构已被证明可以保护金黄色葡萄球菌免受包括万古霉素和咪康唑在内的一系列抗菌药物的侵害，而白色念珠菌本身并未获得对抗真菌药物的额外保护。
尽管对白色念珠菌-金黄色葡萄球菌生物膜进行了广泛研究，但大多数研究依赖于单一的白色念珠菌类型菌株SC5314或其衍生物。然而，最近对224个白色念珠菌基因组的分析显示，只有33%的分离株含有与SC5314中增加的丝状化和生物膜形成相关的Rob1转录因子的显性ROB1S等位基因，这引发了对其临床代表性的担忧。
鉴于抗菌药物对双菌种生物膜的疗效有限，诸如常压低温等离子体（CAP）等替代策略正在被研究。CAP产生反应性氧物种（ROS）和反应性氮物种（RNS），并已广泛用于水净化，对细菌和真菌（包括单菌种生物膜）表现出抗菌活性。虽然已有研究描述了使用CAP完全根除金黄色念珠菌生物膜，但白色念珠菌生物膜表现出更高的耐受性。此外，有强有力的证据表明，低剂量的CAP对宿主细胞不仅耐受良好，而且有助于细胞增殖和组织再生，最终使其成为用于伤口愈合的理想技术。
本研究旨在表征使用代表高（HBF）、中（IBF）和低（LBF）生物膜形成表型的白色念珠菌菌株， alongside 金黄色葡萄球菌USA300（临床相关菌株）、Newman（弱生物膜形成菌）和高生物量临床分离株形成的跨界生物膜。我们评估了双菌种生物膜内金黄色葡萄球菌对万古霉素和白色念珠菌对两性霉素B的耐受性，包括使用和不使用CAP处理的情况。通过将菌株组成、种间相互作用和治疗反应联系起来，本研究为CAP作为针对药物耐受性多微生物感染的生物膜靶向辅助手段提供了见解。
2 材料与方法
2.1 菌株和培养
金黄色葡萄球菌菌株BAA-1717购自ATCC。白色念珠菌SC5314、NCYC 610和ATCC 18804，以及金黄色葡萄球菌Newman和NUI0017已存在于QUB菌株收藏中。白色念珠菌菌株在30°C的沙氏葡萄糖琼脂（SDA）上培养48小时，并在4°C保存。金黄色葡萄球菌菌株使用胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）在37°C培养24小时，并在4°C保存。
2.2 不同生长培养基中酵母的生物膜形成
将白色念珠菌重悬于沙氏葡萄糖肉汤（SDB）中，在30°C、200 rpm振荡培养过夜。然后将培养物在4000 × g离心15分钟，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗两次，重悬并在血细胞计数器上计数。将细胞在RPMI-1640或SDB中稀释至最终浓度为1.0 × 106细胞/mL。将100 μL每种标准化培养物加入96孔平底板孔中，并在37°C静态培养箱中孵育24小时。
2.3 单菌种和双菌种生物膜的培养
白色念珠菌的计数如前所述。将金黄色葡萄球菌在胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中的过夜培养物在4000 × g离心15分钟，用PBS洗涤两次，然后调整至OD550= 0.15–0.18，相当于（1.0 ± 0.2）× 108CFU/mL，并通过Miles和Misra计数法确认。然后将金黄色葡萄球菌在RPMI-1640中稀释至最终浓度为1.0 × 106CFU/mL。使用白色念珠菌与金黄色葡萄球菌比例为1:1、最终浓度均为1.0 × 106细胞/mL的培养物形成双菌种生物膜。使用100 μL单菌种和双菌种培养物接种96孔板孔。单菌种和双菌种生物膜形成的板在37°C静态培养箱中孵育24小时。
2.4 使用结晶紫测定法量化生物膜生物量
如Sherry及其同事所述进行真菌、细菌和双菌种生物膜的生物量量化。简言之，将24小时生物膜用PBS冲洗，然后暴露于0.05% w/v结晶紫中5分钟。然后用PBS冲洗生物膜3次，再用100%乙醇脱色。将乙醇转移至新的96孔板，然后在FLUOstar Omega酶标仪上读取570 nm处的吸光度。
2.5 生物膜中酵母细胞形态的显微镜分析
将生长在96孔板中的白色念珠菌生物膜用PBS冲洗，然后加入100 μL钙荧光白溶液，将板在黑暗中孵育10分钟。移除钙荧光白，用PBS冲洗孔两次。使用DAPI滤光片（激发/发射 357/447 nm）在EVOS M5000荧光显微镜上对孔进行成像。
2.6 生物膜相关细胞的量化
用100 μL PBS洗涤生物膜，然后使用单独的P200吸头刮擦以分离细胞，再加入100 μL新鲜PBS。将板在Branson 3510超声波水浴中超声处理20分钟，以均匀分散聚集的细胞，然后进行计数。将每个孔中的细胞悬液连续稀释，并使用Miles和Misra方法进行铺板：单菌种白色念珠菌生物膜使用SDA，双菌种生物膜中选择白色念珠菌使用添加了10 μg/mL氯霉素的SDA。单菌种金黄色葡萄球菌生物膜的计数使用TSA，双菌种生物膜中选择金黄色葡萄球菌使用甘露醇盐琼脂（MSA）。SDA板在30°C培养48小时，而TSA和MSA板在37°C培养24小时。
2.7 测定万古霉素和两性霉素B对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌生物膜的最低生物膜抑制浓度（MBIC）
将生长24小时的单菌种生物膜用100 μL PBS洗涤，然后向孔中加入100 μL浓度为8、16、32或64 μg/mL的盐酸万古霉素或0.5、1、2、4或8 μg/mL的两性霉素B。然后将板在37°C不振荡的情况下再孵育24小时。将5 μL 10X Alamar blue直接加入到每个孔中含有抗菌药物的培养基中，最终体积为105 μL（0.5X Alamar Blue），包括阳性和阴性对照。根据Peeters等人先前的工作，将板孵育每个生物体的最佳时间（金黄色葡萄球菌生物膜30分钟，白色念珠菌生物膜60分钟），然后在酶标仪上以544 nm激发和590 nm发射测量荧光。MBIC确定为与阳性对照相比导致生物膜代谢活性降低50%的最低抗菌药物浓度，如别处所述。使用针对单菌种生物膜的万古霉素和两性霉素B的MBIC值来确定用于对抗跨界生物膜的抗菌药物浓度（1×、2×和4× MBIC）。
2.8 万古霉素或两性霉素B处理后跨界生物膜的存活率
将生长24小时的跨界生物膜用100 μL PBS冲洗，然后加入100 μL 1×、2×或4× MBIC浓度的万古霉素或两性霉素B。将板在37°C静态孵育24小时。使用上述Miles和Misra方法测定万古霉素处理后存活的金黄色葡萄球菌细胞数量，以及两性霉素B处理后存活的白色念珠菌细胞数量。
2.9 常压低温等离子体处理
内部制造的kHz Jet，由介电石英管（外径6 mm，内径4 mm）组成，带有铜功率电极（距石英管出口15 mm）和铜接地电极（距功率电极上方25 mm），在6 kV下工作，重复频率为20 kHz，如前所述，调整了99.99%的氦气进料气体，流速为2标准升每分钟。对于所有处理，喷枪出口距离96孔板孔顶部设置为5 mm。在处理前，用PBS洗涤生物膜，并去除所有表面液体。然后用CAP处理生物膜，之后在RPMI-1640中加入不同浓度（分别为16、32和64 μg/mL以及0.5、1和2 μg/mL）的万古霉素、两性霉素B或两者。然后将板在37°C静态培养箱中孵育24小时，并使用Miles和Misra方法评估细胞存活率。
2.10 反应性氧物种和氮物种的测量
如上所述进行CAP处理，96孔板孔底部有100 μL水。为了量化过氧化氢（H2O2）、硝酸盐（NO3-）和亚硝酸盐（NO2-），分别使用Amplex Red过氧化氢/过氧化物酶检测试剂盒、硝酸盐Spectraquant检测试剂盒和Griess试剂盒。所有试剂盒均按照制造商的说明书并使用，并如我们小组先前所述进行。
2.11 统计分析
所有统计分析和图表制作均使用GraphPad Prism进行。使用RStudio中的prcomp()函数进行主成分分析（PCA），并使用ggplot2、ggrepel和dplyr进行可视化。
3 结果
3.1 白色念珠菌生物膜形成能力的分类
我们旨在通过总生物量定量和荧光成像来表征白色念珠菌生物膜中菌株特异性差异。结果显示了三种白色念珠菌菌株在两种培养基中生物膜生物量和细胞形态的变异。充分表征的白色念珠菌SC5314在SDB中生长的生物量极少，而在RPMI中生长的生物膜生物量要大得多。在SDB中，SC5314主要保持酵母形态，只有一小部分附着在孔表面并聚集在一起。相反，RPMI诱导了广泛的菌丝形成，并且一层厚厚的、多层的网状结构覆盖了整个孔。这是最强大的生物膜形成菌株，在570 nm处的平均吸光度为2.59。白色念珠菌NCYC 610在RPMI和SDB中的总生物量没有显著差异，在两种培养基中平均吸光度约为0.1 OD570。显微镜检查证实在这两种条件下均完全不存在菌丝或假菌丝形成。与SC5314类似，ATCC 18804在SDB中表现出低总生物量（OD570 = 0.18），主要是酵母细胞形态，菌丝形成极少。然而，当在RPMI中生长时，ATCC 18804生物膜的总生物量显著高于在SDB中生长时，并且假菌丝的表面覆盖度大得多。使用Sherry等人最初建议的临床白色念珠菌菌株的生物膜截止值，我们将SC5314分类为HBF，NCYC 610分类为LBF，ATCC 18804分类为IBF。
3.2 跨界生物膜特性受存在的白色念珠菌菌株影响
为了检查白色念珠菌菌株变异性的影响，我们比较了由高、中、低生物膜形成菌株（分别为SC5314、ATCC 18804和NCYC 610）与三种具有不同生物膜表型的金黄色葡萄球菌菌株形成的跨界生物膜。这些包括USA300、Newman和临床高生物量分离株（NUI0017）。
使用总生物量以及金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的各自细胞计数，我们通过PCA评估了跨界生物膜的亲缘关系。在PCA中，接近度反映了物理特性的相似性。共享相同白色念珠菌菌株的跨界生物膜比共享相同金黄色葡萄球菌菌株的跨界生物膜聚集更紧密，表明真菌菌株对整体结构施加更大的影响。例如，含有SC5314的生物膜无论其金黄色葡萄球菌伙伴如何都紧密分组，而含有NUI0017的生物膜则根据白色念珠菌菌株的不同而更加分散。虽然ATCC 18804与金黄色葡萄球菌USA300和Newman聚类紧密，但当与HBF金黄色葡萄球菌菌株NUI0017配对时，它发生了分化，表明与SC5314相比，NUI0017对ATCC 18804生物膜形成的影响更强。相比之下，NCYC 610生物膜表现出最大的变异，表明金黄色葡萄球菌菌株的影响更强。总的来说，这些发现表明跨界生物膜特性主要由白色念珠菌菌株决定，而金黄色葡萄球菌起次要作用。影响白色念珠菌在跨界生物膜中作用的主要因素是其形成菌丝的能力，这支持了更高的生物量积累和增加的金黄色葡萄球菌附着和增殖。
3.3 单菌种和双菌种跨界生物膜的抗菌耐受性
确定了所有白色念珠菌和金黄色葡萄球菌菌株对万古霉素和两性霉素B的MBIC作为基线参考。无法确定跨界生物膜的MBIC值，因为未受影响的非目标物种可能掩盖了抗菌挑战，主导了生物膜代谢。这种不敏感性可能允许耐药生物主导生物膜，导致观察到的代谢活性几乎没有下降。为了解决这个局限性，使用细胞存活作为抗菌耐受性的指标。为了量化耐受性，在1×、2×和4× MBIC处理后对每个物种的菌落回收进行量化。
对于所有三种金黄色葡萄球菌菌株，与SC5314或ATCC 18804共培养显著增加了对万古霉素的耐受性，与单菌种生物膜相比。与SC5314共培养时，用4× MBIC万古霉素处理的USA300、Newman和NUI0017的回收率分别增加了2.81、3.08和1.98个对数。与ATCC 18804共培养时，USA300、Newman和NUI0017的回收率分别增加了2.54、2.74和2.26个对数。
当与白色念珠菌NCYC 610一起生长时，所有三种金黄色葡萄球菌菌株也表现出对万古霉素的耐受性增加，与USA300、Newman和NUI0017的单菌种生物膜相比，金黄色葡萄球菌细胞回收率分别增加了1.32、0.65和0.9个对数。尽管应该指出，由白色念珠菌NCYC 610提供的保护作用不如由HBF和IBF提供的那么显著。
当与金黄色葡萄球菌共培养时，白色念珠菌通常对两性霉素B变得更敏感。当用4× MBIC两性霉素B处理时，与单菌种生物膜相比，与金黄色葡萄球菌USA300、Newman和NUI0017共培养的SC5314生物膜的真菌细胞数量分别额外减少了0.91、0.56和1.49个对数。低生物膜形成菌株白色念珠菌NCYC 610在跨界生物膜中显示真菌细胞数量显著减少，且随着两性霉素B浓度的增加而增加。在4× MBIC两性霉素B下，在跨界生物膜中观察到白色念珠菌NCYC 610被完全根除，而在单菌种生物膜中注意到减少了1.73个对数。ATCC 18804在作为跨界生物膜生长时，对较低浓度的两性霉素B表现出增加的敏感性。例如，在1× MBIC两性霉素B下，与金黄色葡萄球菌USA300、Newman和NUI0017共培养时，白色念珠菌ATCC 18804生物膜的可存活真菌细胞分别额外减少了1.15、0.75和1.96个对数。在4× MBIC两性霉素B下，比较单菌种生物膜与双菌种生物膜时，对ATCC 18804的抗真菌活性没有显著差异。
3.4 单菌种和双菌种生物膜对常压低温等离子体（CAP）的耐受性
由于其高生物量，选择白色念珠菌SC5314和金黄色葡萄球菌Newman进行CAP耐受性研究。暴露于CAP显著降低了单菌种生物膜中金黄色葡萄球菌的存活率，且呈时间依赖性，15秒后减少1.13个对数，60秒时减少5.72个对数，120秒时完全根除。然而，在与SC5314的双菌种生物膜中，即使在120秒后也未观察到金黄色葡萄球菌细胞的显著减少，这突出表明白色念珠菌提供的保护超出了常规抗菌药物，还包括CAP产生的RONS。白色念珠菌SC5314单菌种生物膜对CAP更具耐受性，30秒后真菌细胞仅减少0.49个对数，并且随着暴露时间延长而逐渐下降。研究表明，H2O2的浓度随着CAP暴露时间的增加而增加，从30秒后的约0.4 mM到120秒后的0.8 mM，这可能是导致细胞死亡的一个因素。有趣的是，比较单菌种和双菌种生物膜时，对于任何CAP暴露时间，白色念珠菌计数没有显著差异，表明金黄色葡萄球菌的存在并未给白色念珠菌提供任何额外的保护。
3.5 CAP和抗菌药物对双菌种跨界生物膜的联合效应
CAP预处理增强了双菌种生物膜中两种生物对抗菌药物的敏感性。在用32和64 μg/mL万古霉素处理之前进行60秒CAP预处理，显著增加了金黄色葡萄球菌的杀灭活性。类似地，当暴露于浓度为1和2 μg/mL的两性霉素B时，CAP预处理导致酵母细胞数量进一步减少。然而，对于任一种抗菌药物，在60秒CAP预处理后，未观察到非目标生物的显著额外减少。
使用最高测试浓度的两性霉素B和万古霉素组合，并在CAP预处理之后，导致双菌种生物膜内金黄色葡萄球菌菌落总数减少2.7个对数。这一减少显著大于未进行CAP预处理时观察到的1.59个对数减少，或单独使用万古霉素和CAP实现的1.15个对数减少。相比之下，与使用2 μg/mL两性霉素B结合CAP预处理所实现的减少相比，添加64 μg/mL万古霉素并未进一步减少跨界生物膜中的白色念珠菌细胞数量。
然而，对白色念珠菌-金黄色葡萄球菌双菌种生物膜的研究几乎完全集中在SC5314菌株上。迄今为止，尚无研究证实该菌株在跨界生物膜中是否代表其他白色念珠菌菌株。此外，SC5314已被证明可以保护金黄色葡萄球菌免受抗菌药物侵害，可能是通过将药物截留在细胞外基质和广泛的菌丝网络中。这就提出了一个问题，即不能形成强大生物膜的白色念珠菌菌株是否仍然可以提供这种保护。无论结果如何，应考虑一种不同的机制来治疗跨界生物膜，特别是考虑到局部微环境的作用，包括营养梯度、氧气扩散限制和细胞外基质（ECM），在塑造生物膜持久性和抗菌耐药性方面。CAP对生物膜具有多机制效应，包括ECM分解和细胞失活，使其比常规抗菌方案更具优势。
4 讨论
基于先前针对SC5314的研究，我们评估了白色念珠菌菌株水平的差异是否影响跨界生物膜的恢复力和对CAP的敏感性。CAP对单菌种生物膜中金黄色葡萄球菌Newman的存活有显著影响。然而，当与白色念珠菌SC5314一起生长时，这种效应消失了，可能是由于双菌种生物膜中生物量和ECM的显著增加。这些结构变化已知会限制CAP的渗透并减少活性物种的扩散。这是CAP生物膜研究中的常见观察结果，我们小组先前报道了在过度产生ECM的伯克霍尔德菌菌株中CAP耐受性增加，并且在更成熟、生物量更丰富的生物膜中，耐受性增加。CAP可能不是作为非选择性的生物膜破坏剂，而是选择性地破坏感染微环境，瞬时削弱ECM完整性和氧化还原平衡，以改善抗菌药物的渗透。
白色念珠菌在其菌丝形态下对过氧化氢更具耐受性，并且亚致死氧化条件可以诱导这种丝状化转变。因此，在短时间CAP暴露后，只有有限的RONS（包括过氧化氢）与白色念珠菌发生反应，并且需要更长的暴露时间来克服生物膜中已存在菌丝的耐受性。先前一项研究观察了CAP对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌双菌种生物膜的影响，并未发现与单菌种生物膜相比，细菌细胞的存活率有显著增加。然而，他们的等离子体源（kINPen）对金黄色葡萄球菌单菌种生物膜的影响远小于本研究中使用的内部kHz喷枪。在另一个包含白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的三元生物膜模型中，共培养时CAP耐受性并未增加，尽管治疗后金黄色葡萄球菌胜过其他生物，这突出了竞争性代谢相互作用在生物膜恢复力中的潜在作用。
添加万古霉素或两性霉素B进一步增强了CAP的效果。CAP预处理，然后使用任一种抗菌药物，导致与单独使用抗菌药物相比，活细胞数量的减少显著更大。CAP、万古霉素和两性霉素B的三重组合对金黄色葡萄球菌产生了最大的效果，这可能是由于CAP产生的过氧化氢破坏了菌丝网络，导致生物膜基质不稳定并增加了药物渗透。此外，先前在单菌种铜绿假单胞菌生物膜中报道了CAP和抗菌药物之间的协同效应，这被认为部分归因于RONS诱导的氧化应激。而CAP和噬菌体的组合也被证明对奇异变形杆菌生物膜比单独使用任一种处理具有更大的抗菌效果。虽然使用万古霉素和两性霉素B的双重治疗确实进一步减少了活细胞计数，但未能完全根除任一物种，这突显了多微生物生物膜的持续挑战。有趣的是，在没有CAP的情况下，使用最高浓度的两性霉素B和万古霉素进行组合治疗，对跨界生物膜中细胞减少的额外影响很小。然而，研究更广泛的浓度范围可能为了解这两种生物在抗菌应激下如何相互作用和适应提供有价值的见解。
我们还表明，跨界生物膜的结构和细胞组成主要由白色念珠菌菌株决定。HBF菌株如SC5314形成致密的菌丝基质，无论细菌菌株如何，都促进了金黄色葡萄球菌生物量的增加。相比之下，LBF菌株如NCYC 610产生的ECM较少，并且更受存在的金黄色葡萄球菌菌株的影响。尽管存在这种变异性，所有白色念珠菌菌株都赋予金黄色葡萄球菌对万古霉素的耐受性增加，尽管程度不同。
SC5314和ATCC 18804提供的保护可能由多种微环境因素驱动，包括致密的生物膜基质截留万古霉素、氧气和营养受限的生态位有利于细菌持久性，以及复杂的菌丝网络提供物理避难所，使金黄色葡萄球菌可以逃避暴露于致死药物浓度。NCYC 610没有显示菌丝形成的迹象，因此缺乏在其他两种菌株中看到的致密丝状网状结构。我们最初假设与金黄色葡萄球菌共培养可能诱导NCYC 610形成菌丝，但这并未得到显微镜分析的支持。观察到的适度保护可能仅由β-1,3葡聚糖介导，它可以部分截留万古霉素，但效果不如在HBF和IBF菌株中看到的联合屏障效应。
与这种保护相反，白色念珠菌本身在与金黄色葡萄球菌共培养时对两性霉素B变得更敏感。我们认为这是由于抗真菌暴露和与金黄色葡萄球菌的营养竞争相结合产生的代谢压力。在这些条件下的膜破坏可能损害白色念珠菌的存活，而金黄色葡萄球菌继续利用残留的基质成分维持其自身持久性。然而，还应考虑在30°C下研究这些生物膜可能会产生不同的结构/代谢，并可能改变每种生物对抗菌药物和CAP的敏感性。
综上所述，这些发现表明，无论菌株如何，白色念珠菌在跨界生物膜内保护金黄色葡萄球菌，包括对抗CAP。然而，CAP作为一种强大的抗生物膜辅助手段，破坏生物膜结构，使抗菌药物更有效地渗透。虽然完全根除仍然难以实现，但这种组合方法值得对临床难治性感染进行进一步探索。
5 结论
白色念珠菌和金黄色葡萄球菌之间的跨界生物膜表现出显著的变异性，具体取决于所涉及的特定菌株。然而，白色念珠菌在与金黄色葡萄球菌相互作用过程中提供的针对万古霉素的保护似乎是一种普遍特征，保护程度与白色念珠菌菌株的生物膜形成能力相关。CAP的使用增强了万古霉素和两性霉素B对跨界生物膜的抗菌活性，并且CAP的免疫刺激作用使其成为一种有前景的技术，有助于解决各种复杂感染。
