《Veterinary Medicine International》：Association Analysis of BRCA1, PPAP2B, and KCNN3 Gene Polymorphisms With Litter Size in Sheep
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本研究通过全基因组重测序与Sequenom MassARRAY SNP分型技术，系统分析了BRCA1、PPAP2B和KCNN3基因在5个绵羊品种中的多态性。研究发现，BRCA1基因的3个位点（g.42581575 T>C、g.42560830 A>T、g.42548851 C>T）在高、低繁殖力品种间存在显著差异（p < 0.01）。其中，PPAP2B基因的g.77092130 G>A位点与小尾寒羊第二胎产羔数显著相关（p < 0.05），GG基因型个体产羔数显著高于AA基因型，为绵羊高繁殖力性状的分子标记辅助选择提供了新的候选靶点。
文章内容归纳总结
1. 引言
繁殖效率是现代绵羊生产体系中最具经济重要性的性状之一，而产羔数作为衡量繁殖成功最直接的指标，受到遗传、营养和管理等多重因素的复杂调控。在分子层面，骨形态发生蛋白受体1B（BMPR1B）基因已被证实是绵羊繁殖性能的主要遗传调控因子。该基因的活性在卵巢组织中受到BRCA1的显著影响，BRCA1作为转录因子，可与BMPR1B启动子区的特定调控元件结合，从而增强其转录活性，促进颗粒细胞存活，并最终提高排卵率。
全球绵羊生产面临的一个持续挑战是大多数品种繁殖活动的显著季节性，这导致全年羔羊供应不均。然而，湖羊是一个显著的例外，其表现出连续、非季节性的繁殖能力，这表明该品种存在独特的生殖生理遗传机制。其中，PPAP2B基因作为一个特别有前景的候选基因脱颖而出。作为进化上保守的脂质磷酸磷酸酶家族成员，PPAP2B编码的Lpp3/Pap2b酶在细胞生长调控和发育过程中发挥重要作用。该基因在发情期湖羊卵巢组织中的动态表达模式及其高表达水平，强烈暗示其参与了非季节性繁殖能力的调控。
繁殖成功的遗传调控不仅限于受孕和排卵，还包括关键的分娩过程。在此背景下，钾通道基因，特别是编码钙激活钾通道的KCNN3基因，因其在调节子宫功能中的潜在作用而引起了研究关注。这些通道在其他哺乳动物中已被充分表征，其在妊娠和分娩期间调节子宫肌层收缩性方面起着至关重要的作用，但其在绵羊繁殖中的具体功能在很大程度上仍未得到探索。新兴证据表明，这些离子通道可能通过多种机制影响繁殖成功率，包括调节子宫肌层兴奋性和调节宫颈成熟过程。KCNN3在绵羊分娩生理学中的潜在参与，为改善繁殖管理和羔羊存活率提供了新的研究途径。
2. 材料与方法
2.1. 实验样本
本研究共采集了5个绵羊品种的样本。多羔羊品种包括：来自山东的384只小尾寒羊、来自江苏徐州的96只湖羊以及来自新疆策勒的96只策勒黑羊。单羔羊品种包括：来自巴彦淖尔乌拉特前旗的96只苏尼特羊和来自巴彦淖尔临河区的96只巴美肉羊。
2.2. 血液DNA提取
从所有绵羊的颈静脉采集血液，经葡萄糖枸橼酸盐抗凝处理后，于-20°C保存。同时，还收集了小尾寒羊的产羔胎次和产羔数记录。
2.3. 引物设计与基因分型
采用Sequenom MassARRAY SNP技术，对PPAP2B基因g.77092130 G>A位点、KCNN3基因g.103522805 C>A位点以及BRCA1基因g.42548851 C>T、g.42581575 T>C和g.42560830 A>T位点进行基因分型。基于GenBank ARS-UI_Ramb_v3.0中绵羊PPAP2B、BRCA1和KCNN3的序列，通过MassARRAY Assay Design v. 3.1设计单碱基延伸引物。单个分型样本所需的DNA量为20 μL，DNA浓度范围为40至80 ng/μL。
2.4. 统计分析
应用Microsoft Excel 2019软件，对绵羊BRCA1基因的g.42548851 C>T、g.42581575 T>C和g.42560830 A>T位点，以及PPAP2B基因的g.77092130 G>A位点和KCNN3基因的g.103522805 C>A位点进行统计分析。统计了基因型频率、基因频率、多态信息含量（PIC）、杂合度（He）和有效等位基因数（Ne），并进行了Hardy-Weinberg平衡检验。采用SPSS 19.0软件中的一般线性模型，分析小尾寒羊基因型与产羔数表型之间的关联，结果以平均值±标准误的形式表示。
3. 结果
3.1. BRCA1、PPAP2B和KCNN3基因SNPs的群体遗传分析
在BRCA1基因中检测到3个SNPs（g.42548851 C>T、g.42581575 T>C和g.42560830 A>T）。所有三个位点均检测到三种基因型。g.42548851 C>T位点在巴美肉羊中具有中度多态性（0.25 < PIC < 0.5），但在其他四个绵羊品种中具有低度多态性（PIC < 0.25）；卡方检验显示，该位点在所有五个绵羊品种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（p > 0.05）。g.42581575 T>C位点在巴美肉羊中具有中度多态性，但在其他四个绵羊品种中具有低度多态性；此外，该位点在除湖羊（p < 0.05）外的所有绵羊品种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（p > 0.05）。g.42560830 A>T位点在巴美肉羊中具有中度多态性，但在其他四个绵羊品种中具有低度多态性；该位点在除湖羊（p < 0.05）外的所有绵羊品种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（p > 0.05）。
在PPAP2B基因中检测到1个SNP（g.77092130 G>A），在KCNN3基因中检测到1个SNP（g.103522805 C>A）。所有两个位点均检测到三种基因型。g.77092130 G>A位点在巴美肉羊中具有中度多态性，但在其他四个绵羊品种中具有低度多态性；该位点在除策勒黑羊（p < 0.05）外的其他四个品种中处于Hardy-Weinberg平衡状态（p > 0.05）。此外，g.103522805 C>A位点在湖羊中具有中度多态性，但在其他四个绵羊品种中具有低度多态性；该位点在小尾寒羊、策勒黑羊、湖羊和苏尼特羊中处于Hardy-Weinberg平衡状态（p > 0.05），但在巴美肉羊中不处于平衡状态（p < 0.05）。
结果显示，BRCA1和PPAP2B基因在小尾寒羊中具有三种基因型，但KCNN3基因仅具有两种基因型。
3.2. 三个SNPs与小尾寒羊产羔数的关联分析
为了解g.42548851 C>T、g.42581575 T>C和g.42560830 A>T与产羔数的关联，对384只小尾寒羊的这三个SNPs进行了关联分析。结果显示，这三个位点的各基因型与小尾寒羊产羔数之间均无显著关联。除未记录产羔数的基因型外，各基因型的产羔数从第一胎到第三胎依次增加。
在g.77092130 G>A位点，第一胎和第三胎不同基因型之间无显著差异（p > 0.05），但小尾寒羊第二胎不同基因型之间存在显著差异，GG基因型与AA基因型之间存在显著差异，且GG基因型显著高于AA基因型（p < 0.05）。
在小尾寒羊的g.103522805 C>A位点，各胎次不同基因型之间的产羔数均未发现显著差异，且仅CC和CA基因型有产羔数记录。然而，图表显示，同一基因型后胎次的产羔数平均值和标准误均大于前胎次。
4. 讨论
4.1. BRCA1基因多态性与绵羊繁殖性能的关系
BMPR1B基因已被充分证实是影响绵羊繁殖性状的主要遗传决定因素。我们的研究结果证实了先前关于BRCA1在调节卵巢颗粒细胞中BMPR1B表达方面的调控作用的报道，突显了这种遗传相互作用在绵羊繁殖中的功能重要性。在巴美肉羊中，所有三个BRCA1位点（g.42581575 T>C、g.42560830 A>T和g.42548851 C>T）均观察到中度多态性（0.25 ≤ PIC < 0.5），表明该品种在选育应用方面具有潜力。
Hardy-Weinberg平衡分析揭示了有趣的品种特异性模式。虽然g.42548851 C>T位点在所有五个研究品种中均保持平衡，但其他两个位点仅在除湖羊外的所有品种中显示平衡。湖羊的这种偏离可能反映了该品种独特的选择压力或群体遗传特征。然而，这些BRCA1多态性与小尾寒羊产羔数之间缺乏显著关联，表明这些特定变异可能不是该品种繁殖力的主要决定因素，暗示其繁殖性能受其他遗传因素的影响。
4.2. KCNN3基因多态性与绵羊繁殖性能的关系
KCNN3基因在生殖生理学中的作用，特别是在分娩期间的作用，得到了转基因小鼠模型证据的支持，该模型显示KCNN3表达的适当调节对于正常的子宫收缩至关重要。我们的研究发现，g.103522805 C>A位点仅在湖羊中表现出中度多态性（0.25 ≤ PIC < 0.5），表明该遗传变异可能与该品种的繁殖特征特别相关。
该位点的Hardy-Weinberg平衡在除巴美肉羊外的所有品种中均得以维持，这与BRCA1多态性观察到的品种特异性模式相呼应。KCNN3多态性与小尾寒羊产羔数之间缺乏显著关联，这与我们的BRCA1研究结果相似，强化了该品种繁殖性能可能受不同遗传因素影响的概念。KCNN3多态性在湖羊中的具体功能意义值得进一步研究，特别是考虑到该品种已知的繁殖特征。
4.3. PPAP2B基因多态性与绵羊繁殖性能的关系
PPAP2B基因编码一种参与细胞信号传导的脂质磷酸酶，已成为绵羊繁殖性能的潜在调节因子，特别是在非季节性繁殖性状方面。我们的研究揭示，PPAP2B基因在湖羊中表现出独特的基因多态性模式，湖羊是一种以全年繁殖能力著称的品种。在特定位点（g.77092130 G>A）观察到的中度多态性表明，PPAP2B可能有助于湖羊独特生殖生理学的遗传基础。
Hardy-Weinberg平衡分析表明，这些PPAP2B变异在除小尾寒羊外的所有品种中均处于平衡状态，小尾寒羊表现出显著偏离（p < 0.05）。这可能意味着影响小尾寒羊PPAP2B等位基因频率的选择压力或遗传漂变。然而，关联分析并未揭示PPAP2B多态性与湖羊产羔数之间存在显著相关性，这表明虽然该基因可能影响繁殖季节性，但它可能不是繁殖力的主要决定因素。在湖羊中观察到的品种特异性多态性模式，突显了其作为改善绵羊育种计划中非季节性繁殖的候选基因的潜力。进一步的功能验证，包括基因表达和基因敲除研究，对于阐明其在绵羊生殖生物学中的确切作用至关重要。
5. 结论
本研究首次分析了PPAP2B基因位点的多态性，并提出该位点（g.77092130 G>A）与小尾寒羊第二胎产羔数存在显著相关性。这些数据为绵羊育种提供了宝贵的遗传标记。
