噬菌体扩增辅助CRISPR/Cas12a技术：突破性检测单增李斯特菌活菌及VBNC状态

《LWT》：Integrating Phage Recognition and Ultrasensitive CRISPR/Cas12a for Breakthrough Detection of Viable-but-Non-Culturable Listeria monocytogenes

为解决单增李斯特菌（L. monocytogenes）在环境胁迫下进入“活的非可培养状态”（VBNC）导致传统检测方法漏检的难题，研究人员开发了一种噬菌体扩增辅助CRISPR/Cas12a检测方法（PAA-CRISPR/Cas12a）。该研究利用噬菌体vB-LmoM-NJ05作为生物识别元件，特异性识别并裂解活菌，释放的子代噬菌体核酸通过CRISPR/Cas12a系统进行信号放大。结果表明，该方法对纯DNA的检测限为4.16 × 101copies/mL，对单增李斯特菌的检测限为3.1 × 101CFU/mL，且能有效区分活菌与死菌，为食品中VBNC状态病原菌的快速、灵敏检测提供了新策略。

在食品安全领域，单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一个令人闻之色变的名字。这种食源性病原菌不仅分布广泛，更可怕的是它能在低温（0–8°C）下生长，对冷藏食品构成严重威胁。更棘手的是，当面临环境压力时，部分单增李斯特菌会进入一种“假死”状态，即“活的非可培养状态”（Viable-but-Non-Culturable, VBNC）。在这种状态下，细菌虽然活着，有代谢活性，甚至可能保持毒力，但无法在常规培养基上生长，导致传统的培养法检测结果为阴性，造成漏检。一旦环境条件适宜，这些“沉睡”的细菌便会复苏，引发食源性疾病，对孕妇、新生儿和老年人等易感人群造成致命威胁。因此，开发一种能够精准区分活菌与死菌，并能有效检测VBNC状态细菌的方法，是保障食品安全和公共卫生的迫切需求。

为了攻克这一难题，来自江苏大学的研究团队在《LWT》杂志上发表了一项创新性研究。他们巧妙地将噬菌体（Phage）的特异性识别能力与CRISPR/Cas12a基因编辑技术的超灵敏检测能力相结合，开发了一种名为“噬菌体扩增辅助CRISPR/Cas12a检测方法”（PAA-CRISPR/Cas12a）。这项研究旨在解决传统方法无法检测VBNC细菌的痛点，为食品中单增李斯特菌的活菌检测提供了一种高效、灵敏且特异的解决方案。

为了开展这项研究，研究人员首先筛选并分离了一株对单增李斯特菌具有高裂解活性的噬菌体vB-LmoM-NJ05。该噬菌体对42株受试菌株的裂解率高达70%，覆盖了主要的致病血清型（1/2a, 1/2b, 4b）。基于该噬菌体的全基因组测序结果，研究人员设计了特异性引物和CRISPR RNA（crRNA），用于后续的核酸扩增和检测。整个检测流程的核心在于“两步法”信号放大：首先，噬菌体作为生物识别元件，特异性感染并裂解样品中的活菌，释放出大量子代噬菌体，实现生物扩增；随后，通过热裂解释放噬菌体DNA，利用CRISPR/Cas12a系统进行核酸水平的信号放大，最终通过荧光信号进行检测。研究人员对反应体系中的关键参数，如共培养时间、Cas12a和crRNA的浓度等进行了系统优化，以确保检测性能达到最佳。此外，研究还通过构建质粒标准品建立了标准曲线，用于精确定量，并评估了该方法在模拟污染的生菜样品中的实际应用效果。

3.1. PAA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立与条件优化

研究人员首先验证了针对噬菌体尾丝和衣壳蛋白基因设计的五对引物的特异性，结果显示所有引物均能产生清晰、特异的扩增条带。通过比较不同引物/crRNA组合在CRISPR/Cas12a系统中的反应效率，最终选择针对尾丝蛋白基因99 bp区域的引物/crRNA对用于后续所有实验。为了确定CRISPR/Cas12a系统对纯化噬菌体DNA的检测限，研究人员测试了系列稀释的DNA样本，结果显示其检测限为2.85 × 10³PFU/mL。为了获得更高的灵敏度，研究团队将噬菌体扩增（PAA）步骤引入检测流程。通过将低浓度的噬菌体（10¹PFU/mL）与宿主细菌共培养，利用噬菌体的裂解循环实现信号放大，成功激活了原本无法检测到信号的CRISPR/Cas12a系统。在条件优化方面，研究人员发现将Cas12a和crRNA的浓度从250 nM降低至25 nM，可以获得更清晰的扩增曲线。同时，通过双层噬菌斑试验和荧光检测，确定8小时为最佳的共培养时间，此时噬菌体滴度已增长至可被CRISPR/Cas12a系统检测的水平。

3.2. 检测限

为了精确定量，研究人员构建了含有靶序列的pUC57质粒，并建立了标准曲线。结果显示，在10¹至10³copies/mL的浓度范围内，终点荧光值与质粒浓度的对数呈良好的线性关系，标准曲线方程为y = 4895x + 7690（R²= 0.985）。基于此，CRISPR/Cas12a系统对纯DNA的检测限被确定为4.16 × 10¹copies/mL。在细菌检测方面，PAA-CRISPR/Cas12a方法对单增李斯特菌NJ05的最低检测限为3.1 × 10¹CFU/mL。

3.3. 特异性与敏感性评估

特异性测试结果表明，该方法仅对单增李斯特菌NJ05和ATCC 13932产生阳性信号，而对其他常见的食源性病原菌，如肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯菌和副溶血性弧菌等均无交叉反应，显示出极高的特异性。宿主范围分析进一步证实，噬菌体vB-LmoM-NJ05能有效裂解42株受试单增李斯特菌中的30株，裂解率高达70%，表明该方法具有良好的应用广谱性。

3.4. VBNC细菌的检测

为了验证该方法检测VBNC状态细菌的能力，研究人员利用FeSO₄诱导单增李斯特菌NJ05进入VBNC状态。通过平板计数和FDA/PI双荧光染色证实，诱导后的细菌失去了可培养性，但细胞膜完整，具有代谢活性，即成功进入了VBNC状态。随后，利用PAA-CRISPR/Cas12a方法检测这些VBNC状态的细菌，结果显示该方法能够有效检测到VBNC状态的单增李斯特菌，证明了其在区分活菌与死菌方面的独特优势。

3.5. 加标样品检测

为了评估该方法在实际样品中的应用潜力，研究人员在生菜样品中人为添加了不同浓度的单增李斯特菌。结果显示，该方法在生菜基质中的检测灵敏度为5.0 × 10¹CFU/mL。在样品处理过程中，加入DNase I和Proteinase K进行预处理，有效提高了信噪比，进一步提升了检测的灵敏度。

研究结论与讨论

本研究成功开发了一种基于噬菌体扩增辅助CRISPR/Cas12a（PAA-CRISPR/Cas12a）的检测方法，用于单增李斯特菌的灵敏、特异检测，并首次实现了对VBNC状态细菌的有效检测。该方法利用噬菌体vB-LmoM-NJ05作为生物识别元件，通过其特异性感染和裂解活菌的特性，实现了对活菌的精准识别，有效避免了死菌DNA的干扰。随后，通过噬菌体在宿主内的扩增，释放大量子代噬菌体，实现了生物水平的信号放大。最后，利用CRISPR/Cas12a系统对噬菌体核酸进行检测，实现了核酸水平的信号放大，从而将检测灵敏度提升至3.1 × 10¹CFU/mL。

该方法的成功之处在于其“双保险”设计：噬菌体确保了检测的特异性和活菌区分能力，而CRISPR/Cas12a则提供了超高的检测灵敏度。与传统的PMA-qPCR方法相比，该方法无需昂贵的染料和复杂的操作，成本更低；与单纯的CRISPR/Cas12a检测相比，它解决了无法区分活菌与死菌的难题。尽管该方法目前需要约8小时的共培养时间，但这实际上起到了预富集的作用，有效解决了痕量病原体检测中假阴性的问题，使其在复杂食品基质中的检测更加可靠。

未来，通过筛选裂解周期更短、宿主范围更广的噬菌体，或结合等温扩增技术（如RPA或LAMP）和微流控芯片技术，有望进一步缩短检测时间，简化操作流程，实现现场快速、高通量检测。总之，这项研究为食品中单增李斯特菌，特别是VBNC状态细菌的监测提供了一种强有力的新工具，对保障食品安全和公共卫生具有重要意义。