《Materials Today Bio》：Targeting Single-Cell Multiomics-Identified Vascular Impairment: Panax notoginseng Extracellular Vesicles-loaded Adhesive QBK-2/EVs Promotes Angiogenesis in Diabetic Wound Healing
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本文针对糖尿病皮肤伤口愈合困难这一临床难题，研究人员通过单细胞RNA测序揭示了血管内皮细胞功能障碍是关键机制，并发现E-选择素（SELE）是三七治疗的关键靶点。为此，他们创新性地开发了一种负载三七细胞外囊泡（EVs）的动态硼酸酯键交联水凝胶（QBK-2/EVs）。该复合系统具有良好的注射性、自愈合性、组织黏附性及活性氧（ROS）/pH响应降解特性。研究证实，QBK-2/EVs能有效下调SELE、上调CD31和F-肌动蛋白（F-actin）等血管生成标志物，促进人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖、迁移和成管，并在糖尿病小鼠模型中显著加速伤口愈合、促进止血、增加胶原沉积和微血管密度。该研究为基于机制驱动的糖尿病伤口治疗提供了新策略。
在全球范围内，糖尿病皮肤伤口是影响超过1860万患者的严重并发症，其高截肢率和高死亡率给医疗系统带来了沉重负担。糖尿病伤口的病理生理学异常复杂，其中血管生成受损被认为是导致组织再生能力低下的核心环节。然而，伤口愈合过程中细胞层面的异质性，以及血管修复障碍背后的具体分子机制仍不明确，这限制了对症治疗策略的开发。
为了揭开糖尿病伤口难愈的神秘面纱，一项发表在《Materials Today Bio》上的研究进行了一项综合性探索。研究人员首先利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，精细描绘了糖尿病伤口组织的细胞图谱。分析结果揭示了一个关键现象：与正常组织相比，糖尿病伤口组织中的血管内皮细胞（ECs）数量惊人地减少了52%，并且具有增殖能力的内皮细胞亚群比例显著下降。这一发现直接指向血管内皮功能障碍是糖尿病伤口愈合延迟的核心病理机制之一。
既然血管问题是关键，那么如何靶向干预？研究团队将目光投向了传统中药瑰宝——三七（Panax notoginseng）。三七以其止血、抗炎和抗氧化活性闻名，但传统提取物存在半衰期短、靶向性差等局限。为此，研究人员采用了更前沿的策略：他们从三七中分离出了细胞外囊泡（EVs）。这些天然的纳米级囊泡具有优异的递送效率、分子运输能力和生物相容性。为了克服EVs在体内易被快速清除的缺点，研究团队匠心独运地设计了一种新型水凝胶递送系统。他们将季铵化壳聚糖-苯硼酸（QCS-BA）与魔芋葡甘聚糖（KGM）通过动态硼酸酯键交联，构建了名为QBK的水凝胶，并将三七EVs负载其中，最终形成了QBK-2/EVs复合材料。
为了精准定位三七的作用靶点，研究结合了网络药理学和分子对接技术。分析筛选出E-选择素（SELE）作为三七干预糖尿病伤口血管内皮细胞的关键靶点。随后的实验验证表明，三七中的多种活性成分（如水杨酸、DFV、二氢平卡品、芦戈卡品、人参三醇、槲皮素等）能与SELE蛋白稳定结合。SELE是一种内皮细胞粘附分子，在炎症状态下高表达，会促进白细胞在内皮聚集，进而抑制血管生成。这为理解三七的作用机制提供了分子基础。
研究人员对制备的QBK-2/EVs水凝胶进行了全面表征。该水凝胶展现出良好的注射性、自愈合能力、强大的组织黏附力（高达42.83 kPa）以及对伤口微环境中活性氧（ROS）和酸性pH值的响应性降解能力。体外研究表明，QBK-2/EVs能有效促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖、迁移和成管能力，其作用机制与下调SELE表达、同时上调血管生成标志物CD31和F-肌动蛋白（F-actin）密切相关。
在糖尿病小鼠伤口模型中的在体实验令人鼓舞。局部应用QBK-2/EVs水凝胶显著加速了伤口愈合过程。与对照组相比，治疗组小鼠的伤口闭合更快，出血得到有效控制，胶原蛋白沉积更丰富，代表新生血管密度的CD31阳性信号也显著增强。组织学分析进一步证实了QBK-2/EVs在促进组织修复和血管再生方面的卓越效果。重要的是，该水凝胶系统表现出优异的生物相容性和血液相容性，对主要器官无毒性作用，具备良好的临床转化前景。
该研究的主要技术方法包括：利用公共数据库（GEO accession: GSE165816）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行分析；通过网络药理学（TCMSP数据库）筛选三七活性成分及靶点，并与糖尿病伤口血管内皮细胞的差异表达基因（DEGs）进行交集分析；采用差速离心法从三七根中分离纯化EVs，并通过透射电镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）进行表征；通过QCS-BA与KGM的交联反应制备QBK水凝胶，并利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、核磁共振氢谱（1H NMR）、扫描电镜（SEM）和流变学分析对其进行表征；通过体外细胞实验（CCK-8、活死染色、细胞骨架染色、划痕实验、Transwell实验、成管实验）和体内糖尿病小鼠伤口模型评价QBK-2/EVs的生物活性和治疗效果；采用RT-qPCR、Western blot、免疫组化/免疫荧光等技术检测相关基因和蛋白（如SELE、CD31、F-actin）的表达。
3.1. 单细胞测序揭示血管内皮功能障碍是主要机制
通过分析糖尿病与非糖尿病患者伤口组织的scRNA-seq数据，研究发现糖尿病伤口组织中血管内皮细胞比例显著降低（减少52%），且增殖性内皮细胞亚群减少。伪时间轨迹分析显示内皮细胞动态转换异常。基因集富集分析（GSEA）表明，在高糖环境下，与血管内皮增殖相关的通路（如细胞周期、DNA复制等）受到显著抑制。细胞通讯分析进一步揭示糖尿病伤口组织中细胞间相互作用频率和强度普遍降低。
3.2. 单细胞测序结合网络药理学揭示三七治疗糖尿病伤口的多个靶点
网络药理学筛选出三七的13种活性成分和863个潜在靶点。与糖尿病伤口血管内皮细胞的差异表达基因取交集，获得100个核心治疗靶点。富集分析提示AGE-RAGE信号通路、FoxO信号通路等是关键通路。分子对接和RT-qPCR验证确定SELE是三七干预糖尿病伤口的关键靶点，其表达在糖尿病条件下上调。
3.3. 三七EVs的分离与表征
采用差速离心法从三七根中成功分离出EVs。透射电镜显示其为均一的膜结合囊泡，纳米颗粒追踪分析显示其粒径分布在142.0至255.0 nm之间。细胞摄取实验证实HUVECs和成纤维细胞能有效内化三七EVs。
3.4. 水凝胶的制备与表征
成功合成了QCS-BA，并通过FT-IR和1H NMR验证。QCS-BA与KGM通过动态硼酸酯键形成QBK水凝胶。该水凝胶具有三维多孔网络结构，储能模量（G'）高于损耗模量（G''），表现为弹性固体。QBK-2/EVs水凝胶具有良好的注射性、自愈合性、组织黏附性（42.83 kPa）以及ROS/pH响应降解和药物释放特性。
3.5. 水凝胶的物理特性、黏附性能及响应性降解
应变扫描表明水凝胶在特定应变下保持结构完整。剪切稀变实验证明其可注射性。交替应变测试证实其优异的自愈合能力。黏附测试显示QBK-2/EVs对猪皮具有强黏附力（42.83 kPa）。水凝胶在酸性（pH 4.5）和高ROS（H2O2）环境中降解加速，表现出微环境响应性。
3.6. QBK-2/EVs水凝胶的生物相容性评价
细胞实验表明，QBK-2/EVs对HUVECs和成纤维细胞无毒性，支持细胞增殖和伸展。溶血实验证实其具有良好的血液相容性。体内实验显示，水凝胶处理的小鼠主要器官无病理改变，血液生化指标正常，系统生物相容性良好。
3.7. QBK-2/EVs水凝胶通过抑制SELE表达促进血管内皮细胞增殖和迁移
体外功能实验证明，QBK-2/EVs能显著促进HUVECs的迁移（划痕实验和Transwell实验）和成管能力。分子水平上，QBK-2/EVs处理下调了SELE的表达，同时上调了CD31和F-actin的表达。Western blot和免疫荧光结果一致证实了该调控作用。
3.8. QBK-2/EVs水凝胶的止血性能
在大鼠断尾和肝部分切除模型中，QBK-2/EVs水凝胶展现出快速有效的止血能力，出血量和止血时间均显著优于对照组和纤维蛋白胶组。其止血机制归因于QCS的正电荷静电吸附作用和水凝胶网络的物理屏障作用。
3.9. QBK-2/EVs水凝胶在体促进糖尿病伤口愈合
在糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型中，QBK-2/EVs治疗组伤口愈合速度显著快于对照组、单纯QBK-2水凝胶组和单纯EVs组。组织学分析（H&E和Masson染色）显示，QBK-2/EVs组伤口胶原沉积更丰富，组织重塑更好。免疫组化显示，QBK-2/EVs组CD31+微血管密度和α-SMA阳性面积显著增加，而SELE阳性细胞比例降低，表明其有效促进了血管生成并减轻了内皮损伤。
4. 结论
本研究通过单细胞测序揭示了糖尿病伤口中血管内皮细胞功能障碍的核心作用，并确定SELE为三七治疗的关键靶点。成功构建的负载三七EVs的QBK-2/EVs复合水凝胶，具备良好的生物相容性、微环境响应性和可控释放特性。该体系能有效下调SELE、上调促血管生成因子，在体内外均显著促进血管内皮细胞功能和组织修复，从而加速糖尿病伤口愈合。这项工作为开发机制驱动的糖尿病伤口治疗策略提供了新思路，即通过精准靶向SELE与水凝胶介导的EVs递送相结合，协同促进血管生成，优化愈合结局。
