tCAP(N3)：一种基于亲和肽辅助、pH触发的位点特异性天然IgG修饰新策略

《Chemistry – A European Journal》：Development of tCAP(N3): Affinity Peptide-Aided, pH-Triggered Strategy for Site-Specific Native IgG Modification

本文报道了一种名为tCAP(N3)的无痕化学偶联方法，该方法利用亲和肽辅助，通过pH触发机制，在天然IgG的Lys248位点实现位点特异性修饰。该策略成功将Ac-Lys(N3)-Gly-Gly有效载荷转移至抗体，生成可进一步与DBCO化合物偶联的二价叠氮化IgG。所制备的抗体偶联物（ADC）保留了与Fc受体（FcRn, FcγR）的结合能力及抗原识别功能，为开发理想的抗体偶联药物提供了精确且高效的平台。

　　

1 引言

抗体偶联药物（ADC）在癌症治疗领域取得了革命性突破，但第一代ADC在临床应用中仍面临诸多挑战。传统的偶联方法通常采用随机偶联策略，如活性酯与氨基的非选择性反应，或马来酰亚胺与部分还原抗体产生的硫醇基团反应，这可能导致产物异质性高、药代动力学性质不稳定等问题。虽然抗体工程技术允许插入额外的残基（如半胱氨酸、非天然氨基酸或标签肽）作为位点选择性修饰的锚点，但生产此类工程化抗体过程繁琐且成本高昂。因此，开发直接靶向天然抗体的位点特异性修饰方法备受关注。

2019年，研究团队开发了化学偶联亲和肽（CCAP）方法，该方法利用针对人IgG的亲和肽，在Fc区域的特定Lys残基上实现位点特异性修饰。然而，CCAP方法的一个主要局限在于，亲和肽在反应后会共价连接在抗体上，这可能会抑制IgG与FcRn的结合，并改变抗体Fc区域的理化性质，从而影响其体内半衰期。

基于此，本研究设想了一种新型抗体修饰试剂，其结构顺序为“有效载荷-活性酯-亲和肽”，旨在将有效载荷转移至靶标抗体，而不留下亲和肽。本研究报道了一种名为“tCAP”的新型试剂，其设计克服了CCAP方法的局限性，能够在不共价连接亲和肽的情况下，产生更简单的抗体偶联物。

2 结果

2.1 叠氮转移试剂“tCAP(N₃)”的设计

tCAP(N₃)的设计基于分子模拟，其亲和肽选择了源自蛋白A片段的Z34C。为了确保有效载荷的高效转移，研究人员确定了PMD(NO₂)单元与肽之间的最佳间隔长度，最终设计出包含Ac-Lys(N₃)-Gly-Gly作为有效载荷的候选试剂tCAP(N₃)，以实现IgG的直接叠氮化。

2.2 tCAP(N₃)的原位自激活及储存稳定性

tCAP(N₃)采用标准Fmoc固相肽合成（SPPS）方法合成。稳定性评估显示，冻干后的tCAP(N₃)在-20°C下可储存超过一年而无明显分解，表现出优异的储存稳定性。其自激活过程具有pH依赖性，在中性条件下可自发生成活性物种MeNbz。

2.3 利用tCAP(N₃)制备叠氮修饰的曲妥珠单抗（Tmab）

将Tmab与四倍摩尔过量的tCAP(N₃)在不同pH条件下混合进行抗体修饰。LC-MS分析显示，在pH 8.9条件下反应完全，生成了二价叠氮修饰的Tmab（Tmab-N₃），质量增加620 Da。还原条件下的质谱分析证实，修饰仅发生在重链上，轻链保持不变。LC-MS/MS分析进一步确认了Lys248位点的特异性修饰。反应后，通过酸性透析可有效去除亲和肽。

2.4 Tmab-N₃与Fc受体的亲和力

表面等离子共振（SPR）分析比较了Tmab与Tmab-N₃对多种Fc受体的结合亲和力，包括FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb以及新生儿Fc受体（FcRn）。结果表明，在Lys248位点进行二价修饰并未显著改变对任何Fc受体蛋白的亲和力。

2.5 从Tmab-N₃制备抗体偶联物

利用应变促进的炔-叠氮环加成反应（SPAAC），将Tmab-N₃与五倍摩尔过量的DBCO功能化有效载荷反应，成功制备了多种抗体偶联物。这些有效载荷包括抗癌药物单甲基澳瑞他汀E衍生物（vcMMAE）、大分子荧光染料IRDye-800CW（IR800）、磷酰二胺吗啉代寡聚物（PMO）以及FcαRI特异性VHH抗体。LC-MS分析证实了二价修饰偶联物的形成，且所有产物的纯度均大于95%。

2.6 通过竞争性ELISA测定ADC的半最大抑制浓度（IC₅₀）值

通过竞争性ELISA测定了各ADC的抗原结合IC₅₀值。结果显示，大多数ADC的IC₅₀值与天然Tmab相当，而Tmab-MMAE的IC₅₀值约增加了两倍，表明偶联后其结合亲和力有轻微下降。

2.7 通过流式细胞术分析制备的ADC的结合特性

使用HER2阳性的SKBR3细胞和HER2阴性的C6细胞，通过流式细胞术评估了制备的ADC的抗原结合能力。结果显示，所有ADC均能特异性结合SKBR3细胞，而在C6细胞上几乎不结合，证实了偶联后抗原识别的保留。

2.8 ADC的FcRn结合能力评估

使用色谱技术评估了ADC与FcRn的结合能力。结果显示，除Tmab-CCAP（二价）外，所有Tmab衍生的偶联物均表现出与天然Tmab相似的保留时间，表明其FcRn结合亲和力得以保留，预计其药代动力学特征与母体IgG相似。

2.9 ADC的FcγRIIIa结合能力评估

使用色谱技术评估了ADC与FcγRIIIa的结合能力。结果显示，Tmab-N₃的洗脱时间略晚于Tmab，而大多数偶联物（除Tmab-IR800外）的洗脱时间进一步延长，表明修饰增强了与FcγRIIIa的相互作用。Tmab-IR800表现出异常强的相互作用，其机制尚需进一步研究。

2.10 ADC的细胞毒性测定

评估了使用tCAP方法制备的ADC（药物抗体比DAR=1.9）对HER2阳性SKBR3细胞的细胞毒性。结果显示，Tmab-vcMMAE和Tmab-ggfgExa均表现出有效的细胞毒性作用，表明通过tCAP方法生成的ADC保留了抗癌活性。

3 讨论

本研究开发的tCAP方法是对CCAP方法的改进，旨在解决亲和肽残留导致的FcRn结合丧失问题。通过采用“有效载荷-活性酯-亲和肽”的顺序设计，实现了有效载荷的无痕转移。tCAP(N₃)利用PMD(NO₂)作为自激活单元，提供了长期的储存稳定性和足够的反应活性。该策略成功实现了对天然IgG的Lys248位点特异性修饰，并保留了抗体的关键生物学功能，包括Fc受体结合和抗原识别，为开发理想的ADC提供了有力工具。

4 结论

tCAP(N₃)可通过标准Fmoc SPPS合成，并在冷藏条件下储存超过一年。该策略能够在Lys248位点选择性引入多种有效载荷，同时基本保留Fc功能和抗原识别能力。因此，这种Fc导向策略为IgG修饰提供了一种精确有效的方法，在控制DAR的同时保持了单克隆抗体的功能，是推进靶向抗体治疗和诊断学发展的通用平台。