《Electroanalysis》：Determination of Paraquat in Real Samples Using a Printed PET-Based Electrode Modified With Molecularly Imprinted Polymer and Carbonaceous Material
摘要
本研究成功开发了一种用于检测水和食品样品中百草枯（PQ）的一次性丝网印刷碳电极（SPCE），该电极采用多壁碳纳米管（MWCNTs）和分子印迹聚合物（MIP）进行修饰，并利用吸附方波伏安法进行测定。MIP通过扫描电子显微镜（SEM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行了表征，结果证实了其组成和化学键。在优化条件下，传感器表现出两个线性响应范围（6.3–200 和 200–500 μmol L?1），R2 = 0.99，灵敏度分别为0.13和0.10 μA/μmol L?1。检测限和定量限分别为3.46和6.30 μmol L?1。方法验证显示了其对PQ的精密度、准确度、稳定性和灵敏度。水样中的回收率在95.1%至98.58%之间，而食品样品（针叶樱桃和苹果）的回收率在83.9%至97.3%之间。这些结果表明该传感器在食品和环境控制中用于PQ分析的潜在应用价值。
1 引言
农药在农业中的大量使用引发了环境问题，主要是由于土壤和水体污染。在这些化合物中，百草枯（PQ）作为一种广泛使用的非选择性除草剂，用于棉花、玉米、大豆和水果等作物的杂草控制。其应用因其高效、低成本和易于使用而受到青睐。然而，PQ对人类和动物具有高毒性，可能导致严重的器官损伤甚至死亡。由于这些风险，它已在多个国家被禁止使用，包括巴西，其国家卫生监督局（ANVISA）于2017年决定禁用，并允许库存使用至2021年。
对PQ的严格监测需要灵敏高效的检测方法。传统技术，如分光光度法和液相色谱-质谱联用，被广泛使用，但其高成本和复杂的基础设施要求限制了大规模应用。在这种情况下，电分析化学方法成为有前景的替代方案，具有高灵敏度、快速分析、低成本和易于微型化等优势。
丝网印刷电极（SPEs）因其便携性、易用性和一次性使用特点而成为重要的分析工具，最大限度地减少了污染问题并简化了分析程序。通过丝网印刷制造，这些电极可以以低成本大规模生产，并具有设计灵活性，使其成为环境监测和质量控制的绝佳选择。
为了增强SPEs的性能，可以采用不同材料进行修饰以提高其选择性和灵敏度。在这些修饰剂中，分子印迹聚合物（MIPs）因其仿生分子识别能力而被广泛应用，类似于酶-底物或抗原-抗体相互作用。这些聚合物具有合成相对简单、成本低和稳定性好等优点。
除了MIPs，碳纳米管（CNTs）也常用于SPE修饰，因为它们具有高机械强度和优异的导电性。这些特性显著增强了电子转移并放大了分析信号，使其成为灵敏电化学应用的理想选择。
MIPs和CNTs在SPE修饰中的结合已被证明是开发选择性和灵敏传感器的有效策略，推动了电分析学的进步，并能够有效检测各种基质中的PQ等化合物。
2 方法论
2.1 试剂
实验使用了多种分析纯试剂，包括磷酸、硼酸、乙酸、盐酸、氢氧化钠、Trizma、Pipes、Hepes、醋酸纤维素、PQ二氯化物、甲基丙烯酸（MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、矿物油、布洛芬（IB）、多菌灵（CZ）、毒死蜱（CP）、多巴胺（DP）、抗坏血酸（AA）、对乙酰氨基酚（AC）、炔雌醇（EE）和敌草快（DQ）等，购自Sigma-Aldrich等公司。多壁碳纳米管（MWCNTs）纯度为99%，直径6-13 nm，长度2.5-20 μm，购自Nanocyl。所有溶液均使用超纯水（电阻率 > 18 MΩ cm，25°C）配制。
2.2 丝网印刷碳电极的开发
电极使用石墨基导电油墨印刷而成，油墨由80%石墨和20%醋酸纤维素在50%丙酮和50%环己酮的溶剂中混合制成。准参比电极使用Ag/AgCl油墨制备。掩模采用透明胶纸并通过切割绘图仪制作，然后应用于PET基底（回收自饮料瓶）。油墨沉积在模具下并用刮刀涂抹，印刷导电油墨后移除掩模，并涂上指甲油以确定电活性区域和电接触点。最终产物称为丝网印刷碳电极（SPCE）。
2.3 MIP的合成
PQ的MIP合成分为两步。首先，将0.5 mmol L?1的PQ（模板分子）和5.0 mmol L?1的MAA（功能单体）溶解于3 mL乙腈中，超声处理1小时以促进单体-模板复合物形成。随后，加入24.5 mmol L?1的EGDMA（交联剂）和0.32 mmol L?1的ACPA（自由基引发剂），持续搅拌并再超声30分钟。混合物在65°C下密封孵育24小时。非印迹聚合物（NIP）作为对照电极，按相同步骤制备但不添加PQ模板分子。合成后，使用甲醇:乙酸溶液（5:1 v/v）、纯甲醇和蒸馏水洗涤MIP以去除模板分子，并通过电化学响应监测去除效果。洗涤后的材料在室温下干燥24小时。
2.4 用于PQ测定的SPCE开发
将4 mg MIP和4 mg MWCNT分散于2 mL N, N-二甲基甲酰胺（DMF）中，超声均质5分钟制备悬浮液。取10 μL该悬浮液滴涂于SPCE工作电极表面，室温干燥约20分钟使材料附着，制得SPCE/MWCNT/MIP电极。SPCE/MWCNT/NIP电极按相同步骤制备。
2.5 优化研究
首先评估了电极修饰的影响，比较了未修饰电极（SPCE）与MIP修饰（SPCE/MIP）、MWCNT修饰（SPCE/MWCNT）以及两者共同修饰（SPCE/MWCNT/MIP）对PQ检测的效率。随后优化了修饰悬浮液的组成，改变了MIP（40%–70%）和MWCNT（60%–30%）的比例。使用Britton-Robinson缓冲液（0.10 mol L?1）在pH 2.00–10.00范围内分析pH影响。比较了不同支持电解质（Hepes, Pipes, Britton-Robinson, Trizma, 磷酸盐）在优化pH下的效果。并评估了离子强度（0.05–0.25 mol L?1）的影响。吸附差分脉冲伏安法（AdDPSV）的操作条件在500 μmol L?1PQ存在下进行优化，优化参数包括积累电位（-200 mV）、积累时间（15 s）、积累时间间隔（4 s）、脉冲幅度（100 mV）、调制时间（5 s）和调制时间间隔（500 ms）。
2.6 表征技术
MIP的电化学表征使用碳糊电极（CPE）作为工作电极，铂丝线圈作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，采用差分脉冲伏安法（DPV）进行。使用PGSTAT204电化学工作站进行测量。MIP和NIP的结构表征使用傅里叶变换红外光谱（FTIR），形态分析使用扫描电子显微镜（SEM）进行。
2.7 分析曲线
在优化实验和操作参数后，构建了PQ的分析曲线。使用AdDPSV技术在含有不同浓度PQ（6.3–500 μmol L?1）的磷酸盐缓冲液（0.1 mol L?1, pH 7.0）中进行分析，重复三次，并根据ANVISA指南评估传感器的线性、灵敏度、检测限和定量限、精密度、准确度、稳定性和选择性。
2.8 选择性和重现性
研究了多种物质（CZ, DQ, CP, DP, AA, EE, AC, IB, TP）在浓度高于PQ 10倍时对PQ检测的潜在干扰。PQ浓度保持为25.0 μmol L?1，干扰物浓度为250.0 μmol L?1。通过日内和日间精密度研究评估SPCE/MWCNT/MIP电极的重现性。
2.9 在实际样品中的应用
将所提出的传感器用于测定不同样品中的PQ，包括实验室自来水、Rio das Mortes河水（巴西米纳斯吉拉斯州圣若昂德尔雷伊）以及当地市场购买针叶樱桃和苹果样品。水果样品经清洗、干燥、切割、均质、稀释、过滤和离心后，取上清液进行分析。样品中添加三种不同浓度（25.00, 125.00, 450.00 μmol L?1）的PQ标准溶液，并使用SPCE/MWCNT/MIP传感器进行分析。
3 结果与讨论
3.1 用于PQ测定的MIP制备
MIP和NIP按方法所述合成。NIP用作参考系统以比较MIP在PQ存在下的行为。只有MIP表面含有检测空腔，而NIP仅由不含PQ模板的单体组成。PQ的缺失影响传感器行为，因为MIP对PQ具有更高的亲和力。使用CPE在0.10 mol L?1磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，存在500 μmol L?1PQ的条件下，通过AdDPSV评估了MIP和NIP的电化学性能。MIP传感器显示出PQ的氧化峰，而NIP传感器也观察到PQ的峰，但强度较低。预期MIP具有对PQ的选择性空腔，因此目标分析物分子与聚合物结合，有利于选择性相互作用并导致电流强度增加。
3.2 MIP模板分子提取
获得MIP后，必须去除模板分子（PQ）。去除模板会创建在大小、形状和官能团上与PQ分子互补的空腔。该过程的效率对于确保材料的选择性至关重要。通过连续洗涤合成的MIP进行去除，并通过电化学测量监测其有效性。与NIP的区别在于NIP没有模板分子。NIP的洗涤遵循与MIP相同的程序，但观察到洗涤不影响电化学响应。因此，NIP的分析在未洗涤状态下进行。与洗涤过程相关的伏安图显示，在前几次洗涤的上清液 aliquot 中仍存在对应于PQ氧化的峰。然而，从第14次洗涤开始，未检测到与PQ相关的电化学响应，表明洗涤程序有效去除了材料中的模板分子。通过比较修饰有未去除模板分子的聚合物（MIP-PQ）的电极和修饰有MIP（洗涤后）的电极来评估洗涤步骤的效率。带有MIP-PQ的电极显示阳极电流峰，证明存在PQ（占据的空腔）。相比之下，带有MIP的电极未显示分析信号，再次证明了分析物去除步骤（模板分子）的效率。该结果确认了去除PQ的洗涤过程的必要性。
3.3 MIP修饰印刷电极的电化学行为
最初的分析仅使用印刷工作电极（WE）进行，随后印刷包含三个电极的器件。在PQ浓度为500 μmol L?1、0.10 mol L?1磷酸盐缓冲液（pH 7.0）的条件下评估了WE的分析潜力。PQ的氧化和还原过程表现出可逆行为，其特征在于约-0.34 V和-0.7 V处的两个氧化峰，以及约-0.84 V和-1.2 V处的两个还原峰。文献表明，-0.70 V处的峰与扩散控制的PQ2+/PQ+对相关，而-1.0 V处的峰代表吸附控制的准可逆PQ+/PQ0还原。观察到的还原峰对应于可逆的氧化还原过程，与文献数据一致，略有向更负电位的偏移。
评估WE的分析性能后，开发了包含辅助电极、工作电极和参比电极的石墨基印刷电极（SPCE）。评估了工作电极修饰对目标分析物响应的影响。评估了以下配置：未修饰（SPCE）、MIP修饰（SPCE/MIP）、碳纳米管修饰（SPCE/MWCNT）以及MIP和MWCNT共同修饰（SPCE/MWCNT/MIP）。分析在0.10 mol L?1磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中使用AdDPSV技术进行。条形图显示了每种电极配置的电流值。对于未修饰的传感器（SPCE），观察到与PQ氧化过程相关的电流值。当用MIP修饰传感器（SPCE/MIP）时，观察到电流略有增加。这种增益可能与溶液中模型分子的高选择性有关，其占据了MIP的空腔，导致灵敏度提高。当将MWCNT添加到传感器表面（SPCE/MWCNT）时，由于该材料的优异导电性能，电流强度增加。SPCE/MWCNT/MIP电极与其他配置相比表现出最大的电流变化。这可能是由于MWCNT的存在有助于提高导电性，而MIP由于其选择性空腔提高了对PQ的选择性。因此，后续研究采用SPCE/MWCNT/MIP配置。
3.4 表征技术
3.4.1 SEM
SEM用于评估材料的形态特征。MIP和NIP的显微照片如图所示。MIP和NIP的形态之间未观察到显著差异，表明模板分子不影响MIP的形态特征。该结果表明MIP的更好性能归因于印迹的选择性位点而非形态特征。还可以注意到材料具有不规则的表面，由不同大小的颗粒组成，这可导致材料的吸附能力。这种形态轮廓对于通过本体法合成的聚合物非常常见。
3.4.2 FTIR
进行FTIR以获得MIP在去除模板分子前后和NIP的官能团信息。图示了这些材料的光谱。图5A显示了洗涤前MIP的光谱。1639 cm?1处的谱带归属于PQ分子中C=N的伸缩振动，而~1570 cm?1处的弱键对应于C-N键的振动。1360 cm?1处的伸缩谱带反映了芳香胺的NH，~828 cm?1处的谱带反映了构成PQ分子的强芳香环。图5B、C显示了洗涤后MIP和NIP的光谱。3568 cm?1处的谱带指代甲基丙烯酸中存在的O-H键的伸缩。约2986和2933 cm?1处的谱带与CH2基团的不对称和对称轴向应变相关。在1721和1634 cm?1处观察到的谱带与交联剂EGDMA中存在的羰基的轴向变形相关。1456和1390 cm?1处的谱带是由于EGDMA酯的O-CH2的角变形。1250 cm?1处存在的谱带指代C-O键的特征角变形，1152 cm?1处的谱带指代C-O键的轴向变形，两者均属于EGDMA。754 cm?1处的谱带对应于面外振动的=C-H角变形。洗涤后MIP和NIP的相似谱带归因于它们相似的化学组成，除了添加模板分子。此外，1639、1570、1360和828 cm?1处谱带的缺失可能表明模板分子的成功去除。
3.5 优化研究
3.5.1 工作电极修饰中MIP用量的优化
评估了用于修饰工作电极的分散液中MIP和MWCNT用量的影响。结果显示，由50% MIP和50% MWCNT组成的悬浮液比其他组成更有效。这种组成更好的电化学性能可能归因于两个因素：（i）MIP的存在提高了传感器的灵敏度和选择性；（ii）MWCNT的存在具有导电性能，改善了传感器的电化学性能。当悬浮液中MIP含量增加时，电流强度降低，这可能与MIP的绝缘特性有关。同时，MIP百分比较低的悬浮液也显示电流下降，这可以解释为用于PQ检测的选择性空腔数量较少。因此，含有50% MIP和50% MWCNT的悬浮液更有效，并用于修饰SPCE以进行后续研究。
3.6 pH对PQ测定的影响
还评估了pH对传感器性能的影响。为此，评估了Britton-Robinson缓冲液0.10 mol L?1的不同pH值（2.0–10.0）。通过阳极峰值电流的变化评估分析响应。对于酸性pH，氢离子（H+）和PQ（PQ2+）之间可能存在对MIP选择性空腔的竞争。对于碱性pH，观察到电流变化减小，这可能由于PQ降解而发生。这种行为，加上峰值电位不随pH变化而移动，表明质子化对PQ还原机制没有影响。因此，选择pH 7.00作为最佳值。
3.7 缓冲液组成和离子强度的影响
还评估了缓冲液的组成。为此，制备了Hepes、Pipes、Britton-Robinson和磷酸盐缓冲溶液，浓度均为0.10 mol L?1，pH 7.00。获得的结果显示，在磷酸盐缓冲介质中获得了最大的电流变化（Δi）。这可能与磷酸根离子更大的迁移率有关，由于该离子尺寸较小，使得电极表面与溶液之间的电荷转移更容易，导致更高的Δi。
通过制备不同浓度（0.05、0.10、0.15、0.20和0.25 mol L?1）的溶液评估了磷酸盐缓冲液浓度的影响。结果显示，对PQ测定产生最大电流变化的浓度为0.10 mol L?1。可以观察到电流变化增加直至0.10 mol L?1，随后增加时电流强度降低。这可能是由于磷酸根离子浓度足以携带溶液中的电荷。高于0.10 mol L?1时，分析物和磷酸根离子之间可能发生竞争，这解释了电流变化强度较低的原因。
3.8 PQ测定的分析曲线
通过应用AdDPSV技术在磷酸盐缓冲液（0.10 mol L?1, pH 7.0）中测定PQ，评估了所提出的SPCE/MWCNT/MIP的电化学性能。通过从6.30到500.0 μmol L?1连续添加递增浓度的PQ进行分析测量。SPCE传感器在两个浓度范围内呈现线性：6.30–200.0 μmol L?1和200.0–500.0 μmol L?1，线性相关系数均为0.99，灵敏度分别为0.13和0.10 μA/μmol L?1。检测限（LOD）和定量限（LOQ）计算为空白溶液标准偏差的3倍和10倍除以灵敏度。发现的值分别为LOD 3.46和LOQ 6.30 μmol L?1。将本研究中发现的线性范围和LOD与文献中报道的其他用于PQ检测的电化学传感器进行了比较。
尽管开发的传感器与文献中报道的某些方法相比未呈现最低的LOD值，但其显著属性突出。所提出的方法提供了简单的制备、低操作成本，并使用易于获取的材料进行电极修饰和印刷油墨生产。印刷电极的制造特点在于其简单性和低成本，使其成为环境监测应用中可行的替代方案。这些方面共同突出了所提出的SPCE在实际系统中使用的潜力。
3.9 选择性、重现性和重复性
在可能存在于水和食品样品中的干扰物种存在下评估了所提出传感器的选择性。为此，评估了化合物如AC、IB、EE、DP、TP、AA、CZ、CP和DQ（浓度高于PQ 10倍）的影响。评估的物质未呈现显著的电化学响应变化或可能影响传感器性能的变异（变异小于5%），除了DQ呈现7.83%的干扰。对DQ的这种干扰是预期的，因为其结构与PQ相似。基于呈现的结果，可以得出结论，使用SPCE/MWCNT/MIP传感器测定PQ的方法符合ANVISA建立的要求。
评估了SPCE的重现性和重复性。为此，在不同日期评估了三个相同的电极，针对不同浓度水平25.0、125.0和450.0 μmol L?1的PQ。结果显示良好的重复性和重现性，浓度25、125和450 μmol L?1的平均RSD分别为0.08、0.01和0.
