从U到mnm5Se2U：通过2-硫族元素和5-甲基氨甲基修饰调控碱基配对偏好性

《Scientific Reports》：From U to mnm?Se2U: tuning base pairing preferences through 2-chalcogen and 5-methylaminomethyl modifications

为解决2-硫族元素（O/S/Se）和5-甲基氨甲基（mnm5）修饰对RNA双链稳定性和碱基配对特异性的协同调控机制尚不明确的问题，研究人员系统性地合成了包含mnm5Se2U在内的多种修饰寡核苷酸，并开展了热力学和结构研究。结果表明，2-硫代修饰（S2U）对腺嘌呤（A）的配对特异性最高，而硒代修饰（Se2U）则表现出更强的鸟嘌呤（G）亲和力；mnm5基团则普遍降低了双链稳定性，并削弱了碱基配对的选择性。该研究为理解tRNA摆动密码子识别机制及设计高特异性治疗性核酸提供了关键的理论依据。

在生命体精密的蛋白质合成工厂中，转运RNA（tRNA）扮演着至关重要的“搬运工”角色。它们通过其反密码子环上的三个碱基，精准地识别信使RNA（mRNA）上的密码子，从而确保氨基酸被正确地装配到蛋白质链上。然而，大自然并非总是遵循严格的“A对T，G对C”的碱基配对规则。在反密码子的第一位（即第34位，又称摆动位点），碱基配对常常表现出一定的灵活性，这种灵活性使得一个tRNA可以识别多个同义密码子，极大地提高了遗传密码的解读效率。

为了精确调控这种灵活性，细胞进化出了一套精密的化学修饰系统。其中，尿苷（Uridine, U）的2-硫族元素（Chalcogen）和5-甲基氨甲基（5-methylaminomethyl, mnm⁵）修饰尤为引人注目。这些修饰广泛存在于细菌tRNA中，通过改变尿苷的电子密度、酸碱性和构象，来“微调”其与密码子第三位碱基（通常是A或G）的配对偏好性。例如，2-硫代尿苷（S²U）能显著增强与A的配对，同时抑制与G的错配，从而确保翻译的准确性。而5-甲基氨甲基-2-硫代尿苷（mnm⁵S²U）则表现出一定的“简并性”，能够同时识别A和G，这被认为是细菌应对特定氨基酸（如谷氨酸）密码子使用偏好的一种策略。

尽管这些修饰的生物学功能已被部分揭示，但关于2-硫族元素（O/S/Se）和mnm⁵基团如何协同调控RNA双链的稳定性、结构以及碱基配对特异性的系统性研究仍不充分。特别是对于2-硒代尿苷（Se²U）及其mnm⁵修饰形式（mnm⁵Se²U）的研究更是凤毛麟角。这些修饰不仅对理解tRNA的生物学功能至关重要，也为设计高稳定性、高特异性的治疗性核酸（如反义寡核苷酸、siRNA）提供了宝贵的化学工具。

为了填补这一空白，来自波兰罗兹理工大学和波兰科学院分子与高分子研究中心的Grazyna Leszczynska和Barbara Nawrot团队在《Scientific Reports》上发表了一项题为“From U to mnm⁵Se²U: tuning base pairing preferences through 2-chalcogen and 5-methylaminomethyl modifications”的研究。该研究首次报道了mnm⁵Se²U修饰RNA寡核苷酸的化学合成，并通过系统的热力学和结构分析，揭示了2-硫族元素和mnm⁵基团在调控RNA双链性质中的独特贡献。

关键实验方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   化学合成：通过磷酰胺固相合成法，首次成功合成了含有mnm⁵Se²U修饰的RNA寡核苷酸，并合成了包含U、S²U、Se²U、mnm⁵U和mnm⁵S²U的对照寡核苷酸。
2. 2.
   热力学分析：利用紫外（UV）熔解实验，在pH 7.4、7.0和6.4条件下，测定了12种不同修饰RNA双链的熔解温度（Tm）和热力学参数（ΔG°、ΔH°、ΔS°），以评估其稳定性和碱基配对偏好性。
3. 3.
   结构表征：通过圆二色谱（CD）技术，分析了所有修饰RNA双链的二级结构，确认其均保持了典型的A型RNA双螺旋构象。

研究结果

1. 2-硫族元素对双链稳定性的影响：S²U > Se²U > U

研究人员设计了两组RNA双链，分别包含修饰碱基与A（Watson-Crick配对）或G（错配）的配对。热力学分析显示，在与A配对时，2-硫族元素的引入显著增强了双链的稳定性，但其增强效果并非如预期般随原子序数增加而递增。相反，稳定性顺序为：S²U > Se²U > U。具体而言，S²U-A双链的稳定性比未修饰的U-A双链高出约2 kcal/mol，而Se²U-A双链的稳定性则介于两者之间，且显著低于S²U-A双链。

这一结果挑战了传统的教科书观点。通常认为，硒（Se）比硫（S）具有更强的电负性和更大的原子半径，应能形成更强的氢键，从而更有效地稳定双链。然而，研究人员指出，Se²U的N3-H酸性更强（pKa = 7.30），导致其在生理pH条件下有高达58%的分子以离子化形式存在。这种离子化形式虽然增强了N3的氢键受体能力，但可能破坏了与A形成标准Watson-Crick碱基对所需的氢键模式，从而削弱了其与A的配对能力。相比之下，S²U的离子化程度较低（17%），其优势构象更有利于形成稳定的S²U-A碱基对。

2. mnm⁵基团的普遍去稳定化效应

研究还发现，5-甲基氨甲基（mnm⁵）基团的引入对双链稳定性产生了显著的负面影响。无论是与A还是G配对，mnm⁵修饰的尿苷（mnm⁵U、mnm⁵S²U、mnm⁵Se²U）所形成的双链，其稳定性均低于相应的未修饰或仅2-硫族元素修饰的尿苷。

这种去稳定化效应主要归因于mnm⁵基团在生理pH条件下倾向于形成两性离子（Zwitterionic）结构。在这种结构中，侧链的氨基被质子化，而尿嘧啶环的N3-H则发生去质子化，导致整个分子带正负电荷。这种电荷分布的改变削弱了碱基间的氢键相互作用，从而降低了双链的稳定性。其中，mnm⁵Se²U的酸性最强，其两性离子形式占比超过90%，因此其与A配对的双链稳定性最低。

3. 碱基配对特异性的调控：S²U对A的偏好性最强

为了评估修饰碱基区分A和G的能力，研究人员计算了ΔΔG°值，即修饰碱基与A配对的双链稳定性减去其与G配对的双链稳定性。ΔΔG°值越大，表示该修饰碱基对A的偏好性越强。

结果显示，碱基配对特异性（对A的偏好性）遵循以下顺序：S²U > Se²U > U。这表明2-硫代修饰（S²U）是提高RNA双链中U与A配对特异性的最有效策略。

4. mnm⁵基团诱导的简并性

一个有趣的发现是，mnm⁵基团的引入显著降低了碱基配对的特异性。与未修饰的尿苷相比，所有mnm⁵修饰的尿苷（mnm⁵U、mnm⁵S²U、mnm⁵Se²U）的ΔΔG°值均减小，表明它们对A和G的区分能力下降，表现出“简并性”。这种简并性使得mnm⁵修饰的tRNA能够识别以A或G结尾的同义密码子，这与它们在细菌体内调控翻译的生物学功能是一致的。

5. pH依赖性的热稳定性变化

为了探究离子化状态对双链稳定性的影响，研究人员在不同pH（6.4, 7.0, 7.4）条件下进行了热熔解实验。结果发现，对于含有S²U-G或Se²U-G错配的双链，其稳定性随着pH的降低（酸性增强）而显著下降。这可能是由于在酸性条件下，离子化形式的S²U或Se²U的硫族原子（S/Se）被质子化，从而削弱了其与G形成稳定碱基对的能力。

结论与讨论

本研究通过系统的化学合成和热力学分析，首次揭示了2-硫族元素和5-甲基氨甲基修饰对RNA双链性质的协同调控机制。研究得出了以下关键结论：

1. 1.
   2-硫族元素的独特贡献：2-硫代修饰（S²U）是增强RNA双链稳定性（与A配对）和提高碱基配对特异性（对A的偏好性）的最有效策略。而2-硒代修饰（Se²U）虽然也能增强稳定性，但其效果弱于S²U，并且表现出更强的G亲和力，这与其高离子化倾向有关。
2. 2.
   mnm⁵基团的“简并化”效应：mnm⁵基团通过诱导两性离子结构的形成，普遍降低了RNA双链的稳定性，并削弱了碱基配对的特异性，使得修饰碱基能够更“宽容”地识别A和G。这一发现为理解细菌tRNA如何通过化学修饰来调控基因表达提供了直接的实验证据。
3. 3.
   pH调控的双链稳定性：S²U和Se²U修饰的双链稳定性具有pH依赖性，这为未来设计环境响应型的核酸药物提供了新的思路。

这项研究不仅深化了我们对tRNA摆动密码子识别机制的理解，也为设计下一代治疗性核酸提供了重要的理论指导。例如，在需要高特异性和高稳定性的反义寡核苷酸或siRNA设计中，S²U修饰将是一个理想的选择；而在需要一定“简并性”以应对基因突变或提高药物效力的场景下，mnm⁵修饰则可能发挥独特的作用。