《Cell Biomaterials》：An enhanced mucus-penetrating miRNA delivery system for effective inhibition of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice
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本研究针对特发性肺纤维化(IPF)治疗中因气道黏液屏障导致传统RNA递送效率低下的难题，开发了一种新型氟化两性离子聚氨酯(PFSBU)纳米平台用于雾化递送miR-26a。该平台通过协同作用实现高效黏液穿透、ROS清除和靶向基因调控，显著减轻BLM诱导的小鼠肺纤维化病理特征，为RNA疗法治疗纤维化疾病提供了创新策略。
肺纤维化是一种致命的肺部疾病，其特征是肺部组织出现不可逆的瘢痕形成，导致肺功能进行性丧失。特发性肺纤维化(IPF)作为其中一种常见类型，患者诊断后的中位生存期仅约3.5年，预后极差。目前临床使用的抗纤维化药物如吡非尼酮和尼达尼布，虽然能够在一定程度上延缓疾病进展，但存在疗效有限、副作用明显以及长期获益不确定等问题。更为棘手的是，IPF患者的肺部存在异常增厚的黏液层和慢性炎症微环境，这就像一道坚固的屏障，极大地阻碍了治疗药物（尤其是大分子的核酸药物，如microRNA）有效抵达病变的肺细胞。因此，开发能够突破这道屏障，将治疗性核酸安全高效递送至肺部的创新技术，成为当前IPF治疗研究领域的迫切需求和重大挑战。
RNA疗法，特别是microRNA(miRNA)治疗，在调控基因表达和治疗复杂疾病方面展现出巨大潜力。研究表明，miR-26a在多种纤维化疾病中表达下调，其具有抑制成纤维细胞活化和细胞外基质(ECM)过度沉积的保护性作用。然而，如何将miR-26a成功递送至充满黏液的纤维化肺部并发挥疗效，是一个关键的科学难题。传统的阳离子递送载体很容易被带负电的黏液网络捕获并快速清除，导致肺组织深处的药物积累不足。
为了攻克这一难题，来自浙江大学的研究团队在《Cell Biomaterials》上发表了一项创新性研究，他们设计并构建了一种多功能纳米递送系统。该系统的核心是一种新型的氟化两性离子聚氨酯材料，命名为PFSBU。研究人员巧妙地将两性离子基团（用于减少与黏液的静电相互作用）和氟化侧链（用于增强穿透能力）整合到聚合物骨架中，同时骨架中还含有硫缩酮(TK)结构，使其能够响应纤维化微环境中高水平的活性氧(ROS)并发挥清除作用。由此形成的PFSBU纳米颗粒能够高效装载miR-26a，形成稳定的纳米复合物(PFSBU@miR-26a NPs)。研究人员设想，通过雾化吸入方式给药后，这些纳米颗粒能够像“特洛伊木马”一样，巧妙地穿越稠密的肺黏液屏障，进入目标细胞，释放miR-26a，从而同时发挥抗炎、抗氧化和抗纤维化的协同治疗效果。
为验证这一设想，研究人员综合运用了多种关键技术方法。他们首先通过化学合成和表征（如核磁共振NMR、凝胶渗透色谱GPC、傅里叶变换红外光谱FTIR）制备并确认了PFSBU材料的结构。利用体外模型（如人工黏液穿透实验、细胞毒性试验、细胞内吞和溶酶体逃逸观察）评估了纳米颗粒的理化性质、生物相容性和细胞摄取效率。研究核心建立在博来霉素(BLM)诱导的C57BL/6小鼠IPF模型上，通过雾化吸入方式给予治疗，并采用组织病理学分析（H&E染色、Masson染色、天狼星红染色）、免疫组化/免疫荧光（检测α-SMA、COL1A1等纤维化标志物）、酶联免疫吸附测定(ELISA)（检测TGF-β、IL-1β等细胞因子）以及生物化学检测（羟脯氨酸含量、SA-β-Gal活性）等手段全面评价疗效。最后，通过对小鼠肺组织进行RNA测序(RNA-seq)和生物信息学分析（如KEGG通路富集分析），深入探讨了其作用的分子机制。
制备和表征PFSBU@miR-26a NPs
研究人员成功合成了具有不同全氟辛烷硫醇(PFO)接枝度的PFSBU聚合物，并从中筛选出接枝度为35%的PFSBU作为最优载体，因其在小鼠肺上皮细胞(MLE-12)中表现出最高的基因转染效率。透射电子显微镜(TEM)显示，当PFSBU与miR-26a的质量比为30:1时，能形成均匀的球形纳米颗粒，粒径约为150-180纳米，且分散性良好。纳米颗粒在溶液中以及经过雾化处理后均能保持稳定的尺寸和分散性，证明了其适用于吸入给药的物理特性。理论计算（密度泛函理论DFT）表明，PFSBU与miRNA之间通过氢键、范德华力和静电相互作用实现强效结合。此外，琼脂糖凝胶电泳证实PFSBU能快速且稳定地结合miRNA，其效率优于常用的商业化载体聚乙烯亚胺(PEI)。重要的是，PFSBU分子中的TK结构单元使其具备显著的抗氧化能力，能够有效清除ABTS自由基。
增强的细胞内在化和内体逃逸
细胞实验表明，PFSBU纳米颗粒具有良好的细胞相容性，即使在较高浓度下对A549和MLE-12细胞的活力也无明显影响，而PEI则在浓度超过60 μg/mL时表现出明显毒性。通过共聚焦显微镜观察发现，PFSBU@miRNA NPs能被细胞有效内吞，并能在4小时内成功从溶酶体中逃逸，其效率远高于PEI组。流式细胞术定量分析进一步证实，PFSBU介导的细胞对miRNA的摄取呈浓度依赖性，且效果优于PEI。
黏液穿透能力及体内生物分布
利用体外人工黏液模型进行评估，结果显示，得益于其两性离子骨架和氟化侧链的协同作用，PFSBU纳米颗粒展现出卓越的黏液穿透能力，显著优于非两性离子对照组(PPFTU)、未氟化的两性离子对照组(PUSB4)以及PEI组。在小鼠体内实验中，通过雾化吸入给予Cy5.5标记的miRNA纳米制剂后4小时采集主要器官进行荧光成像，发现所有组的荧光信号都集中在肺部，证实了吸入给药的靶向性。其中，PFSBU@miRNA组在肺部的荧光信号强度最高，表明其具有最优的肺部递送效率。肺组织冰冻切片成像也显示PFSBU NPs在肺叶内分布更均匀、更密集。
PFSBU@miR-26a NPs在体内抑制BLM诱导的肺纤维化
在BLM诱导的小鼠肺纤维化模型中，经过14天的雾化治疗后，PFSBU@miR-26a NPs治疗组表现出最佳的治疗效果。组织学分析（H&E染色）显示，该治疗组能显著减少炎症细胞浸润、恢复肺泡结构、减轻组织水肿和实变。支气管肺泡灌洗液(BALF)分析表明，总蛋白浓度和炎症细胞总数也显著降低。ELISA检测发现，促纤维化关键因子TGF-β和促炎因子IL-1β的水平在PFSBU@miR-26a NPs组降至最低。Masson染色和天狼星红染色结果显示，胶原沉积被明显抑制。免疫组化和免疫荧光分析进一步证实，成纤维细胞活化标志物α-SMA和胶原蛋白COL1A1的表达显著下调。此外，肺组织中代表胶原总量的羟脯氨酸含量以及细胞衰老标志物SA-β-Gal的活性也均在PFSBU@miR-26a NPs组得到最有效的降低。重要的是，对主要器官的H&E染色分析未发现明显毒性迹象，提示了该纳米系统的良好生物安全性。
NP治疗组治疗肺纤维化后的RNA-seq分析
转录组测序分析为阐明治疗机制提供了深入见解。与BLM模型组相比，PFSBU@miR-26a NPs治疗引起了最显著的基因表达变化，共有725个基因上调和171个基因下调。KEGG通路富集分析显示，差异表达基因显著富集于免疫相关通路（如细胞因子-细胞因子受体相互作用）以及纤维化-代谢相关通路（如ECM-受体相互作用、MAPK信号通路）。值得注意的是，多个与纤维化相关的基因，如Fgf23、Hspa1a和Hspa1b，在治疗后显著下调。这些结果从分子水平表明，PFSBU@miR-26a NPs通过调节免疫反应和细胞代谢过程，协同减轻BLM诱导的纤维化。
综上所述，这项研究成功地开发了一种新型的、具有黏液穿透性和ROS响应性的氟化两性离子聚氨酯纳米递送平台PFSBU，用于治疗性miR-26a的肺部吸入递送。该平台巧妙地将高效的核酸装载、卓越的黏液屏障穿透能力、有效的细胞内吞和溶酶体逃逸、以及针对纤维化微环境的ROS清除功能整合于一体。研究在BLM诱导的小鼠IPF模型中证实，雾化吸入PFSBU@miR-26a NPs能显著改善肺部病理状况，减轻炎症和氧化应激，抑制成纤维细胞活化和ECM过度沉积，从而有效逆转肺纤维化进程。深入的转录组学分析揭示了其通过调控多条免疫和代谢相关通路发挥作用的分子机制。
该研究的创新之处在于其多功能的载体设计，不仅克服了肺部RNA递送的主要生物屏障，而且载体本身（通过TK基团）与治疗性miRNA（miR-26a）产生了协同抗纤维化效应。与传统的阳离子载体PEI相比，PFSBU展现出更优的安全性、递送效率和治疗效果。这项工作为IPF及其他伴有黏液屏障的呼吸系统疾病的RNA疗法开发提供了新的思路和极具前景的纳米技术平台，标志着向临床转化迈出了重要的一步。当然，研究的长期疗效和安全性仍需进一步评估，未来利用更接近人类疾病的模型（如类器官或大型动物模型）进行验证将有助于推动该技术的临床应用。
