《Cell Reports Methods》：In vivo AGO-APP for cell-type- and compartment-specific miRNA profiling in the mouse brain
编辑推荐：
为克服现有miRNA分析技术在细胞类型和亚细胞分辨率上的局限，Kapoor等人开发了两种表达T6B肽的转基因小鼠品系，首次实现了活体条件下特定神经元及其突触后致密区(PSD)的AGO亲和纯化(AGO-APP)，揭示了嗅球中间神经元与皮层兴奋性神经元截然不同的miRNA特征及其突触富集模式，为神经环路的精确调控机制研究提供了强大工具。
在我们的大脑中，微小的RNA分子——microRNA（miRNA）扮演着基因表达"精密调节器"的重要角色。这些长度约22个核苷酸的非编码RNA通过与Argonaute（AGO）蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体（RISC），调控着超过60%的蛋白质编码基因的表达。然而，由于技术限制，科学家们一直难以在活体动物中精确解析特定脑细胞类型甚至亚细胞区室（如突触）中的miRNA表达谱。传统方法如荧光激活细胞分选（FACS）对形态复杂的神经元效果有限，而原位杂交技术则因miRNA分子太小且存在多重靶向性而面临挑战。更关键的是，细胞中表达的miRNA并非全部都与AGO蛋白结合并发挥功能，只有"活性"部分才真正参与基因调控。
在这一研究背景下，来自法国艾克斯-马赛大学的研究团队在《Cell Reports Methods》上发表了他们的最新成果。他们成功开发了两种创新的转基因小鼠模型，首次实现了活体条件下细胞类型特异性和突触区室特异性的miRNA分析。这项技术突破为我们理解大脑中miRNA的精确功能调控机制打开了新窗口。
研究人员采用的核心技术方法包括：利用Cre-loxP系统实现细胞类型特异性表达的转基因小鼠模型构建；通过AGO亲和纯化（AGO-APP）技术分离AGO结合的miRNA；使用优化的AQ-seq方案进行小RNA测序；结合电生理记录和形态学分析验证突触功能；采用生物信息学方法进行差异表达和基因本体（GO）富集分析。实验样本来源于转基因小鼠的嗅球和皮层组织。
Sustained expression of T6B in neuronal progenitors does not perturb postnatal neurogenesis
研究人员首先探讨了miRNA通路在神经发生中的重要性。他们发现，通过条件性敲除Dicer基因完全破坏miRNA通路会导致嗅球新生神经元的大量丢失，表明miRNA通路对 postnatal neurogenesis至关重要。接着，他们测试了T6B肽（源自人TNRC6B蛋白的80个氨基酸片段）的表达是否会影响神经发育。体外实验显示，T6B表达对皮质神经元树突生长无显著影响；体内实验进一步证实，在嗅球神经前体细胞中持续表达T6B不会干扰神经发生过程，新生神经元能够正常整合和存活。基于这些发现，研究人员成功构建了Cre依赖性表达T6B-FHY（FLAG-HA-EYFP融合标签）的转基因小鼠品系。
miRNA isolation from brain tissue by in vivo AGO-APP
本研究的核心创新在于利用T6B肽与所有AGO蛋白结合的特性，开发了活体AGO-APP技术。T6B能够取代内源性TNRC6蛋白与AGO-miRNA复合体结合，从而通过抗GFP纳米抗体实现特异性富集。研究人员分别使用Nestin-CRE-ERT2和NeuroD6-CRE-ERT2驱动子，在嗅球抑制性中间神经元和皮质兴奋性神经元中表达T6B-FHY，成功从脑组织匀浆中分离出细胞类型特异性的AGO结合miRNA。测序结果显示，不同生物学重复之间高度一致，证明了该方法的可靠性。尽管两种神经元类型的miRNA组整体保守（Spearman相关系数r=0.76），但研究人员鉴定出了显著差异表达的miRNA：嗅球神经元中miR-200家族和miR-183/96/182簇显著富集，而皮质神经元中则有30种miRNA特异性高表达，其中多个与神经系统疾病相关。
Analyzing miRNA expression at the postsynapse
为研究突触区室特异性的miRNA分布，研究人员构建了第二类转基因小鼠品系，将T6B-FHY与突触后致密蛋白95（PSD95）融合表达。免疫荧光和电镜分析证实PSD95-T6B-FHY特异性地定位在兴奋性突触的突触后区。重要的是，表达该融合蛋白的神经元仍保持正常的稳态可塑性能力。通过比较全细胞与突触后区室的AGO-APP样品，研究人员发现了两类神经元中特异性富集于突触后的miRNA集合。基因本体分析显示，这些突触富集的miRNA靶向的mRNA显著富集于突触功能相关术语，提示它们可能参与突触特异性调控。
研究结论与讨论部分强调，活体AGO-APP技术有效克服了传统miRNA分析方法的多个局限。该技术无需细胞分离即可从复杂脑组织中特异性捕获"活性"miRNA，且可通过分子标签靶向特定亚细胞区室。研究发现不同神经元类型虽然共享核心miRNA组，但存在定量差异和细胞类型特异性表达模式，且突触后miRNA的富集具有细胞类型特异性，可能由生理环境而非miRNA本身特性决定。需要注意的是，在某些条件下T6B表达可能干扰miRNA功能，因此在应用于其他细胞类型时需进行充分验证。
这项研究的重要意义在于提供了首个在活体脊椎动物大脑中实现细胞类型和突触区室分辨率miRNA分析的技术平台，为深入研究神经系统发育、可塑性及相关疾病的分子机制奠定了方法学基础。未来通过结合神经元活动调控，该技术有望揭示miRNA在学习记忆等高级脑功能中的动态调控机制。
