《Renal Failure》：Long non-coding RNA NEAT1 mediated lupus nephritis induced podocytes pyroptosis through DNMT1–STING axis
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本研究揭示了狼疮性肾炎（LN）中长链非编码RNA NEAT1通过直接结合并调控DNA甲基转移酶1（DNMT1），进而上调干扰素基因刺激因子（STING）表达，最终导致足细胞焦亡（pyroptosis）的新机制。文章阐明了NEAT1/DNMT1/STING信号轴在抗体介导的肾小球损伤中的核心作用，为LN的靶向治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。
NEAT1介导狼疮性肾炎足细胞焦亡的机制探索
摘要
狼疮性肾炎（Lupus Nephritis, LN）是系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus, SLE）最严重的并发症之一，其特征是自身抗体沉积介导的足细胞损伤，但其潜在机制尚未完全阐明。本研究探讨了长链非编码RNA核富集丰富转录本1（NEAT1）在足细胞焦亡（pyroptosis）中的作用及其与干扰素基因刺激因子（STING）通路的相互作用。研究发现，NEAT1通过直接结合DNA甲基转移酶1（DNMT1），形成NEAT1/DNMT1/STING信号轴，成为LN中足细胞焦亡的关键调控因子，为抗体介导的肾小球损伤提供了新的治疗靶点。
引言
系统性红斑狼疮（SLE）是一种慢性自身免疫性疾病，以全身性炎症和多器官损伤为特征，其中狼疮性肾炎（LN）是其最严重的并发症之一。近半数SLE患者会发展为LN，其特征是肾小球内免疫复合物沉积，导致足细胞损伤、蛋白尿和进行性肾功能不全。足细胞是终末分化的肾小球上皮细胞，对于维持滤过屏障的完整性至关重要。越来越多的证据表明，焦亡——一种由gasdermin D（GSDMD）介导的裂解性、炎症性程序性细胞死亡方式——是LN中足细胞丢失的关键驱动因素。该过程涉及NLRP3炎症小体（inflammasome）的激活以及随后促炎细胞因子如IL-1β和IL-18的释放，从而加剧肾脏损伤。尽管免疫抑制疗法取得了进展，但连接自身抗体与足细胞焦亡的分子机制仍不清楚，这凸显了对新治疗靶点的需求。
近期研究暗示干扰素基因刺激因子（STING）通路在自身免疫病理中发挥作用。STING是一种胞质DNA传感器，在SLE中异常激活，驱动I型干扰素产生并放大炎症反应。在狼疮易感小鼠中，STING的过度活跃会加剧肾小球损伤，表明其在LN进展中的核心作用。同时，在SLE患者中观察到DNA甲基转移酶1（DNMT1）的失调——这种酶对维持CpG甲基化至关重要——其与整体低甲基化和自身免疫基因激活相关。有趣的是，长链非编码RNA（lncRNAs），如核富集丰富转录本1（NEAT1），越来越多地被认为是自身免疫性疾病中的表观遗传调控因子。NEAT1在糖尿病肾病中促进NLRP3炎症小体激活，并在SLE中增强巨噬细胞炎症。然而，其在LN相关足细胞焦亡中的作用以及与STING或DNMT1的潜在相互作用尚未被探索。
NEAT1介导LN-IgG诱导的足细胞炎症因子释放
SLE患者表现出循环炎症细胞因子水平升高，LN作为一种严重的肾脏并发症，其炎症特征需要明确。对25名初治LN患者和20名健康捐赠者（NC）血浆细胞因子的分析显示，与NC相比，LN患者IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ和TNF-α显著增加。值得注意的是，尿液足标蛋白（podocalyxin）——足细胞损伤的生物标志物——在LN患者中升高了五倍，与疾病活动度（SLEDAI-2000）相关。从机制上讲，NEAT1被确定为足细胞功能障碍的潜在介质。LN患者外周血单核细胞（PBMCs）中NEAT1的表达比NC高3倍。为了建立因果关系，研究人员从LN患者血浆中分离出IgG并在体外处理人足细胞（HPCs）。LN-IgG诱导了剂量依赖性的细胞毒性，在1000 μg/mL时细胞活力降至61±7%，同时伴随着NEAT1的上调（2.3倍）以及IL-1β、IL-18、IFN-γ和TNF-α分泌的增加。而NC-IgG（1500 μg/mL）未显示细胞毒性或细胞因子诱导作用，证实了LN-IgG的特异性。功能获得和功能缺失研究表明NEAT1在此过程中的核心作用。过表达NEAT1（pcDNA-NEAT1）加剧了LN-IgG诱导的炎症细胞因子释放，而敲低NEAT1（sh-NEAT1）则减弱了细胞因子的产生。这些发现表明NEAT1是LN-IgG驱动的足细胞损伤和炎症的关键放大器。
NEAT1驱动狼疮性肾炎小鼠模型中的足细胞损伤和肾脏炎症
为了确立NEAT1在LN发病机制中的体内相关性，研究人员采用了MRL/lpr狼疮易感小鼠模型。与MRL/MpJ对照小鼠相比，MRL/lpr小鼠在18周龄时，其PBMCs中NEAT1表达高出五倍，肾组织中高出三倍。这种上调与进行性足细胞损伤相关，表现为尿液足标蛋白排泄量增加四倍，尿蛋白（UP）排泄量增加两倍。通过尾静脉注射递送sh-NEAT1的慢病毒实现了肾脏NEAT1的敲低，显著降低了尿液足标蛋白水平。全身性炎症也相应减轻，血浆IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ和TNF-α降低。小鼠肾脏的电镜结果显示，在LN组，足细胞（SC）表现出焦亡样变化，具有焦亡细胞的特征。细胞膜（→）局部受损，存在多泡体（Mvb）。而在sh-NEAT1组，足细胞未见水肿，胞质均匀，细胞膜结构完整。
LN-IgG通过NEAT1诱导足细胞焦亡
IL-1β/IL-18分泌升高提示LN-IgG可能引发焦亡——一种以gasdermin孔形成为特征的裂解性细胞死亡机制。NLRP3炎症小体在细胞焦亡中起关键作用。免疫印迹显示，LN-IgG（100–1500 μg/mL）剂量依赖性地上调了HPCs中的焦亡执行蛋白：NLRP3、ASC和切割的GSDMD（GSDMD-N）。鉴于先前有报道NEAT1在巨噬细胞中调控NLRP3，研究人员探究了其在足细胞中的作用。NEAT1过表达（pcDNA-NEAT1）与LN-IgG协同作用，放大了NLRP3、ASC和GSDMD-N的表达。相反，敲低NEAT1（sh-NEAT1）抑制了这些效应。功能上，NEAT1过表达加剧了细胞死亡，而NEAT1敲低则改善了细胞存活。体内验证显示MRL/lpr小鼠比MRL/MpJ对照小鼠具有更高的肾脏NLRP3、ASC和GSDMD阳性细胞。慢病毒sh-NEAT1减少了NLRP3、ASC和GSDMD阳性细胞，证实了NEAT1在物种间的保守作用。
NEAT1通过上调STING增强足细胞焦亡
STING已被报道通过使用小鼠模型在SLE和LN疾病表型中发挥关键作用。本研究中，研究人员旨在阐明STING是否在NEAT1介导的足细胞焦亡中发挥作用。他们证实NEAT1表达水平在LN患者PBMCs中升高。与此一致的是，LN患者PBMCs中STING mRNA升高了2.8倍，并且与NEAT1水平呈强正相关。在体外，LN-IgG（1000 μg/mL）同时上调了足细胞中的NEAT1和STING。这些数据表明STING表达与NEAT1表达正相关。NEAT1过表达增加了HPCs中STING的表达，而敲低NEAT1表达则降低了STING表达，这提示NEAT1双向调控STING。值得注意的是，研究发现使用sh-STING敲低HPCs中的STING表达并不影响NEAT1的表达水平，暗示STING可能作用于NEAT1的下游。功能研究表明，STING敲低：消除了LN-IgG诱导的焦亡标志物（NLRP3、ASC和GSDMD-N）；减弱了细胞因子释放（IL-6、IL-1β、IL-18、IFN-γ和TNF-α）。这些数据将STING定位为NEAT1驱动焦亡的关键执行者，且不受反馈调节影响。
STING敲低减轻狼疮性肾炎小鼠的肾脏焦亡
为了验证体内的NEAT1/STING轴，研究人员评估了MRL/lpr狼疮易感小鼠肾组织中的STING表达。与MRL/MpJ对照相比，LN小鼠表现出更高的STING mRNA和STING蛋白水平，这与先前关于自身免疫性肾损伤中STING上调的报道一致。慢病毒sh-NEAT1递送降低了肾脏STING表达，证实了NEAT1依赖的STING调控。为了剖析STING的功能作用，研究人员通过尾静脉注射给予sh-STING。成功的STING敲低减轻了全身性炎症，降低了血浆炎症细胞因子和UP排泄。小鼠肾脏的电镜结果显示，敲低STING与敲低NEAT1具有相同的结果：足细胞的焦亡形态得到改善。关键的是，STING沉默抑制了焦亡标志物：NLRP3、ASC和GSDMD-N，这与显示NLRP3炎症小体抑制可减轻肾脏病理中焦亡的研究一致。值得注意的是，STING敲低并未改变NEAT1表达，证实STING严格作用于NEAT1下游。
NEAT1可能招募DNMT1以表观遗传方式调控LN中的STING
DNA甲基转移酶1（DNMT1）是一种介导CpG岛甲基化的关键酶，通过异常的表观遗传调控与狼疮发病机制相关。基于NEAT1在癌症模型中与DNMT1相互作用的报道，研究人员在LN中研究了这一轴心。临床分析显示，与健康捐赠者相比，LN患者PBMCs中DNMT1 mRNA高出2.2倍，与NEAT1上调平行。在体外，LN-IgG（1000 μg/mL）诱导了剂量依赖性的DNMT1上调（2.3倍），这一效应被NEAT1敲低所消除。值得注意的是，STING沉默并不影响DNMT1表达。相反，过表达DNMT1增加了STING的表达，并消除了sh-NEAT1对细胞焦亡标志物（NLRP3、GSDMD和ASC）的影响，证实DNMT1作用于STING上游。从机制上讲，RIP（RNA免疫共沉淀）实验显示，在DNMT1免疫沉淀物中NEAT1富集了18倍（相对于IgG对照）。RNA pull-down（RNA下拉）实验进一步证实了NEAT1与DNMT1的直接结合，这与lncRNAs支架DNA甲基转移酶到特定基因组位点的发现一致。在体内，MRL/lpr小鼠表现出2.3倍更高的肾脏DNMT1，这一现象通过NEAT1敲低得以恢复正常。这些数据建立了一个NEAT1/DNMT1/STING调控轴，其中NEAT1招募DNMT1来调节STING甲基化——这是一种最近被牵涉到自身免疫基因沉默的机制。
讨论
LN是SLE的严重并发症之一。尽管LN治疗取得了进展，但目前大多数治疗都是免疫抑制药物，只能缓解症状。LN的发病机制复杂，目前尚未完全明了。鉴于受LN影响的SLE患者比例很高，通过发现LN可能的发病机制来寻找新的有效治疗方法显得尤为重要。
足细胞作为肾脏肾小球滤过屏障的关键角色，当其受损或死亡时会导致蛋白尿，这是LN的一个标志。LN-IgG可以攻击、损伤足细胞。反过来，足细胞可以对损伤作出反应并分泌炎症细胞因子，对肾脏造成进一步损害。因此，保护足细胞免受损伤和防止炎症细胞因子释放可能是一个治疗靶点。本文提供的数据证实了LN-IgG损伤足细胞（通过足标蛋白释放指示），并显示LN-IgG增加了足细胞炎症细胞因子的分泌。长链非编码RNA NEAT1被确定为癌症生物标志物，并已被发现在几种不同的癌症中发挥重要作用。NEAT1也被发现在大鼠模型的糖尿病肾病中发挥重要作用。本研究中，研究人员证明HPCs通过增加NEAT1表达来响应LN-IgG，这与炎症细胞因子释放增加呈正相关。功能获得和缺失研究表明NEAT1可能在足细胞焦亡中发挥作用，这通过IL-1β和IL-18的释放以及NLRP3、GSDMD和ASC的蛋白表达水平来指示。
干扰素基因刺激因子（STING）是环二核苷酸传感器和先天免疫反应的关键参与者。STING敲除小鼠在无病原体环境中通常健康，但易发生致命感染。鉴于STING在足细胞炎症和损伤中发挥作用，它可能成为LN的一个极佳治疗靶点。没有证据表明STING直接或间接与NEAT1相互作用。本研究发现NEAT1诱导足细胞中STING的表达，而NEAT1敲低则降低了STING表达。然而，敲低STING对NEAT1的表达水平没有影响。这项研究表明STING可能作用于NEAT1下游，激活NLRP3炎症小体并诱导足细胞焦亡。NEAT1与DNMT1的内源性结合为研究人员感兴趣的研究方向提供了线索。
总之，研究数据表明，足细胞对LN-IgG作出反应，导致足细胞损伤、炎症细胞因子释放和焦亡，这些过程至少部分由NEAT1介导。此外，STING可能在NEAT1下游的足细胞损伤、炎症细胞因子释放和焦亡中发挥作用。然而，详细的分子机制有待进一步研究。综上所述，NEAT1/DNMT1/STING信号轴可能成为LN的治疗靶点。
