《The Journal of Biochemistry》：Whole-blood transcriptomics in a Japanese population cohort: physiological and methodological insights
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为解决健康人群全血转录组学基线数据稀缺、生理变量影响不明及珠蛋白mRNA处理缺乏共识等问题，Aoki等人对日本东北医疗超大型队列（TMM）的576名参与者进行了大规模全血RNA测序（RNA-seq）研究。该研究通过保留珠蛋白转录本并辅以计算机去除的双重策略，不仅成功检测出罕见的遗传性胎儿血红蛋白持续症（HPFH）病例，还揭示了中性粒细胞与淋巴细胞比率（NLR）是转录组变异的主要驱动因素，并系统阐明了年龄、性别及妊娠状态对基因表达谱的深刻影响。该研究为建立日本人群特异性全血基因表达参考图谱提供了标准化数据和实用方法学指导，对推动精准健康研究具有重要意义。
想象一下，如果一滴血就能告诉我们身体内部正在发生的一切，那该多好？全血转录组学（Whole-blood transcriptomics）正是这样一个充满希望的技术。它通过分析血液中所有RNA分子的表达情况，为我们提供了一种无创、便捷地窥探全身生理状态和免疫系统状况的窗口。然而，尽管技术飞速发展，这个领域依然面临着几个棘手的难题，限制了它在人群研究和临床应用中的潜力。
首先，在健康人群中进行的系统性转录组分析数据非常稀缺。我们很难知道一个“正常”的血液基因表达谱应该是什么样子。其次，像年龄、性别这样的基本生理变量，到底会对血液基因表达产生多大的影响？这种影响在不同人群中是否一致？这些问题都还没有明确的答案。最后，一个技术上的“拦路虎”一直困扰着研究者：血液中高达80%的RNA都是珠蛋白（globin）mRNA，它们就像背景噪音一样，会淹没其他基因的信号。那么，在分析前到底该不该把这些珠蛋白mRNA去掉？如果去掉，会不会丢失一些重要的生物学信息？这些问题都悬而未决。
为了填补这些空白，Aoki等人开展了一项雄心勃勃的研究。他们利用日本东北医疗超大型队列（Tohoku Medical Megabank Project, TMM）的资源，对576名健康参与者进行了全血RNA测序（RNA-seq）。这些参与者涵盖了男性和女性，年龄跨度从20-39岁的年轻组到60-79岁的老年组。这项研究的主要目标，就是为日本人群建立一个标准化的、分层的全血基因表达参考图谱，为未来的精准医学研究打下坚实的基础。
为了回答这些问题，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，他们利用日本东北医疗超大型队列（Tohoku Medical Megabank Project, TMM）的576名健康参与者，进行了全血RNA测序（RNA-seq）。其次，他们创新性地采用了双重珠蛋白处理策略，即在测序文库构建时保留珠蛋白转录本，生成包含珠蛋白的原始数据集，同时通过计算机算法进行珠蛋白读段去除，生成可用于常规下游分析的珠蛋白去除数据集。此外，研究还整合了参与者的临床指标，包括血常规中的白细胞分类计数，并运用了主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）、差异表达基因分析以及基因集富集分析（Gene-Set Enrichment Analysis, GSEA）等生物信息学方法。
A dual strategy for handling globin transcripts
珠蛋白转录本处理的双重策略
面对珠蛋白mRNA的挑战，Aoki等人没有选择在实验阶段将其去除，而是采取了一种更为灵活和全面的双重策略。他们首先保留了珠蛋白转录本，生成了一个未经过滤的、包含完整血红蛋白基因表达谱的数据集。同时，他们又通过计算机算法（in silico）去除了珠蛋白读段，生成了第二个版本的数据集，用于常规的下游分析。
这一策略带来了意想不到的收获。通过分析完整的珠蛋白表达谱，研究人员在人群中发现了7名个体（约占队列的1.2%）表现出持续升高的胎儿珠蛋白表达。这一发现强烈提示这些个体可能患有遗传性胎儿血红蛋白持续症（Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin, HPFH），这是一种良性的遗传性状。如果按照传统方法在实验阶段就去除了珠蛋白，这些携带者将完全无法被检测到。此外，作者还证实，通过计算机算法去除珠蛋白读段后，非珠蛋白转录组的分析质量依然可靠，这为该方法作为实验去除的灵活替代方案提供了有力支持。这些发现表明，珠蛋白转录本不仅仅是技术噪音，它们本身也蕴含着重要的生物学信息，能够揭示人群遗传学和血液学特征。
Immune-cell composition as a major source of transcriptomic variance
免疫细胞组成是转录组变异的主要来源
该研究的一个核心发现是，免疫细胞组成，特别是中性粒细胞与淋巴细胞比率（Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio, NLR），是驱动全血转录组全局变异的最主要因素。主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）显示，第一主成分与NLR高度相关，这表明血液转录组对主要免疫细胞群体的相对丰度高度敏感。
这一发现具有双重重要意义。首先，它强调了在人群或临床研究中解读全血转录组时，必须考虑免疫细胞组成的影响。如果不进行这种校正，基因表达上的明显差异可能实际上仅仅反映了白细胞比例的变化。其次，第一主成分与NLR的强相关性表明，全血RNA测序本身就编码了关于免疫细胞组成的信息。虽然NLR本身可以通过常规血常规检查轻松获得，并可以作为简单的协变量纳入模型，但更全面的免疫细胞组成校正则需要采用反卷积（deconvolution）等更复杂的方法。通过明确将NLR确定为变异的主要来源，作者为未来的模型应该包含哪些协变量提供了实用的指导，也为基因表达数据与标准血液学指标的综合分析提供了一个有用的框架。
Age, sex, and physiological states as axes of variation
年龄、性别和生理状态作为变异轴
年龄、性别和生理状态是影响免疫功能和全身生理状态的主要生物学决定因素。Aoki等人利用TMM队列，在一个统一的框架下考察了它们对全血转录组的影响。
在年龄相关的对比中，研究人员发现了基因表达上的显著差异。有趣的是，女性在衰老过程中表现出比男性更多的差异表达基因（女性1,309个，男性366个）。基因集富集分析（Gene-Set Enrichation Analysis, GSEA）显示，老年男性主要表现出细胞周期相关通路的下调，包括G2M检查点和E2F靶点；而女性则表现出涉及免疫和代谢通路的更广泛的转录组变化。这些观察结果与之前报道的免疫衰老的性别偏向特征一致。
除了衰老，作者还在年轻参与者中发现了基线性别差异。女性表现出更高的干扰素刺激基因（Interferon-Stimulated Genes, ISGs）和免疫反应通路的表达，而男性则表现出氧化应激相关和代谢基因的表达升高。这些发现与免疫学文献中报道的抗病毒免疫和氧化应激反应的已知性别特异性特征相符。
此外，妊娠状态为队列内的生理变异提供了另一个维度。尽管孕妇样本数量有限，但她们表现出一致且独特的转录组特征，包括NRF2相关的氧化应激反应基因（如GLRX和TXN）的上调，以及免疫调节基因（如PDLIM1）的下调。这些变化与妊娠伴随的氧化还原和免疫调整相一致，并且可能与母胎耐受机制有关。即使在样本量有限的情况下，这些特征的清晰度也凸显了全血转录组学对生理状态的敏感性，并为未来研究日本人群妊娠相关免疫调节提供了基础。
研究结论与讨论
Aoki等人的研究意义远不止于其直接发现。通过利用一个特征明确的前瞻性队列，作者开始为日本人群建立了一个标准化的、按人口统计学分层（stratified）的全血基因表达基线。将RNA测序数据与临床指标（包括白细胞分类计数）相结合，创造了一个多功能的数据集，可以支持日本人群的表达数量性状位点（eQTL）定位、疾病生物标志物发现、免疫监测工作，并可能为个性化医疗提供支持。
该研究的一个核心贡献在于其双重珠蛋白策略。通过保留珠蛋白转录本并随后进行计算机减法，Aoki等人证明，包含珠蛋白的测序可以保留具有生物学意义的信息（如罕见的胎儿血红蛋白表型），同时仍然允许对非珠蛋白基因进行高质量分析。这为灵活、基于生物学信息的RNA测序工作流程提供了强有力的理由，而不是自动进行珠蛋白去除，并为研究人员设计未来的全血转录组学研究提供了实用指导。
总而言之，这些特征使该数据集成为日本全血转录组学的宝贵资源。其战略性的研究设计——保留珠蛋白转录本、应用计算机去除、按年龄和性别分层、整合血液学参数——说明了谨慎的方法学选择如何能够将全血RNA测序从纯粹的描述性检测，转变为一种更具机制性的工具，用于探索人类生理学。尽管未来还需要在年龄范围、地区和纵向时间点上进一步扩展，以建立一个更完整的日本参考图谱，但这项工作代表了朝着这个方向迈出的重要一步。它既提供了数据，也提供了一个有用的概念框架，有助于开发人群特异性的参考标准，以支持日本未来的精准健康计划，并可能作为全球其他基于人群的队列的参考点。
