《Nucleic Acids Research》：3D enhancer architecture coordinated by CTCF determines immune-related gene expression patterns via RNA polymerase II pause-release in CD4+ T cells
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本研究聚焦于CTCF在CD4+T细胞三维基因组结构和基因调控中的关键作用。研究人员通过多组学技术揭示，CTCF缺失导致增强子-启动子互作显著重组，但STAT5结合的超增强子(SEs)驱动的活跃转录能独立维持增强子环化。研究发现，稳健的增强子-启动子互作与RNA聚合酶II(RNAPII)暂停释放相关，并依赖CTCF介导的3D基因组组织来塑造免疫相关基因表达谱。尤为重要的是，CTCF缺失通过重构STAT5增强子网络而非改变上游JAK/STAT信号通路，重编程了CD4+T细胞对JAK抑制剂的转录应答。该研究发表于《Nucleic Acids Research》，为理解3D基因组结构与免疫基因精准调控提供了新机制见解。
在免疫系统中，CD4+T细胞扮演着核心角色，其活化和功能发挥依赖于精确的基因表达调控。众所周知，哺乳动物基因组在细胞核内呈现出高度有序的空间结构，包括染色体疆域、区室化结构、拓扑关联域(TADs)和染色质环等多个层次。CTCF（CCCTC结合因子）作为关键架构蛋白，与黏连蛋白(cohesin)协同介导染色质环挤出，形成TADs和染色质环，从而将增强子和启动子约束在特定空间范围内进行互作。然而，CTCF在增强子-启动子特异性互作及其对基因转录精确调控中的作用，尤其是在免疫细胞中，仍有许多未知。
当CD4+T细胞被抗原激活后，白细胞介素-2（IL-2）作为其主要生长因子，通过JAK/STAT信号通路（特别是STAT5转录因子）触发关键的转录重编程，决定T细胞的分化和稳态。尽管已有研究表明CTCF在T细胞发育和细胞因子表达中不可或缺，但其如何整合IL-2等外部信号，通过三维增强子网络精细调控T细胞特异性基因表达的机制尚不清晰。为了解决这一关键问题，来自延世大学医学院的李恩钟（Eun-Chong Lee）、金炅宇（Kyungwoo Kim）等研究人员在《Nucleic Acids Research》上发表了他们的最新研究成果。
为了深入探索CTCF的功能，研究人员构建了他莫昔芬诱导的Ctcf条件性敲除（CreER; CTCFf/f）小鼠模型，并从中分离CD4+T细胞进行体外激活和基因敲除操作。研究团队运用了多种前沿的高通量测序技术来全面解析CTCF缺失后的多维变化，包括：RNA测序（RNA-seq）分析基因表达谱；染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）检测CTCF、SMC1A、STAT5、组蛋白修饰（H3K27ac、H3K4me1、H3K4me3、H3K27me3）及RNA聚合酶II Ser5磷酸化（Pol2S5P）的基因组定位；ATAC-seq（转座酶可及染色质测定）评估染色质开放性；精密核运行测序（PRO-seq）捕捉新生RNA转录以评估RNAPII的暂停情况；原位Hi-C描绘全基因组染色质互作；以及H3K27ac HiChIP（一种聚焦于活性增强子的染色质构象捕获技术）来高分辨率地绘制增强子为中心的染色质互作图谱。通过对这些海量数据的整合分析，研究人员系统地揭示了CTCF在CD4+T细胞三维增强子架构和转录调控中的核心作用。
增强子环的形成受CTCF和活跃转录共同促进
研究人员发现，CTCF缺失导致CD4+T细胞中由H3K27ac HiChIP检测到的增强子环数量显著减少，表明CTCF对维持增强子环结构至关重要。有趣的是，即使在没有CTCF的情况下，一部分增强子环仍然存在，且这些环的锚点区域显示出更高的转录活性（通过PRO-seq和Pol2S5P ChIP-seq信号衡量）和活跃的染色质标记（如H3K27ac、H3K4me3）。研究人员根据环的强度将HiChIP环分为超级环（super-loops）和典型环（typical-loops）。超级环的锚点区域显示出更强的SMC1A（黏连蛋白亚基）富集、更活跃的染色质状态和更低的转录暂停指数，表明活跃的转录本身也有助于形成稳健的染色质互作，这在一定程度上可以补偿CTCF的缺失。
STAT5结合的超增强子驱动稳健的增强子环形成
通过分析环锚点区域的转录因子结合 motif，研究发现，在CTCF缺失的细胞中，免疫相关转录因子如STAT5的 motif 在超级环的锚点区域显著富集。进一步分析证实，STAT5信号通路在CTCF缺失后仍保持活性。特别重要的是，研究人员发现绝大多数超增强子（SEs）都有STAT5结合，并且随着环强度的增加，环锚点与SEs的重叠比例显著上升，尤其是在CTCF缺失的细胞中。这表明STAT5结合的SEs是形成强增强子环的关键驱动因素，尤其是在CTCF缺失的情况下，它们的作用更为突出。
稳健的增强子-启动子互作与RNA聚合酶II暂停释放相关
基因表达分析显示，与SEs通过增强子环相连的基因，其表达水平更高，并且转录暂停指数（衡量RNAPII在启动子近端暂停的指标）更低，意味着RNAPII能更有效地从暂停进入延伸阶段。这种关联在由强增强子环（超级环）连接的基因中尤为明显。此外，研究还发现，增强子环的强度与启动子区域的H3K4me3水平（与转录起始和暂停释放相关）对转录暂停的负向调控作用密切相关。这些结果提示，强健的增强子-启动子互作通过促进RNAPII的暂停释放，从而高效激活细胞身份基因（如免疫相关基因）的表达。
稳健的增强子-启动子互作需要CTCF来塑造CD4+T细胞的免疫相关基因表达模式
CTCF缺失导致增强子环网络发生广泛重排，既有环的丢失，也有新环的获得。丢失的环绝大多数至少有一个锚点结合了CTCF，而新获得的环锚点则富集了STAT5等转录因子的结合。值得注意的是，CTCF缺失对由超级环连接的基因影响最大：在野生型细胞中由超级环连接的免疫相关基因，在CTCF缺失后近一半失去了环连接，其表达下降，转录暂停增加；相反，一些原本未连接超级环的持家基因，在CTCF缺失后获得了与SEs的新连接，表达上调。这表明CTCF不仅帮助维持增强子环，还作为绝缘子防止SEs错误地激活非免疫相关基因，从而确保免疫基因表达的特异性。
CTCF缺失通过重构STAT5增强子网络改变对JAK抑制剂的转录应答
为了探究CTCF依赖的3D结构在生理条件下的功能，研究人员用JAK抑制剂（tofacitinib）处理细胞。结果发现，CTCF缺失改变了CD4+T细胞对tofacitinib的转录应答谱，但这种改变并非由于上游JAK/STAT信号通路本身的变化（STAT5磷酸化水平在WT和KO细胞中对tofacitinib的反应相似），而是源于CTCF缺失导致的STAT5增强子网络重构。具体而言，一些STAT5靶基因因为CTCF缺失而获得了与STAT5结合增强子的新连接，从而对tofacitinib更敏感（表达下降更明显）；而另一些则因连接中断而敏感性降低。
基因组编辑验证重构的STAT5增强子环改变JAK抑制后的转录应答
为了直接验证增强子环重构的功能，研究人员使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，特异性敲除了位于SEs中的STAT5结合基序（GAS motif）。例如，在Dexi基因座，CTCF缺失导致一个STAT5结合的SE与Dexi启动子形成新的超级环，使Dexi表达上调且对tofacitinib更敏感。当敲除该SE中的STAT5结合位点后，仅在CTCF缺失的细胞中观察到Dexi表达的特异性下降，证实了这种新环连接的功能依赖性。同样，在Igfbp4基因座，CTCF缺失破坏了一个原有的STAT5-SE-Igfbp4超级环，导致其表达下降和对tofacitinib的敏感性改变，该效应也可通过编辑远端STAT5结合位点来验证。这些实验有力地证明了CTCF缺失通过改变3D增强子架构，进而重编程STAT5靶基因的表达和对药物应答。
本研究阐明了CTCF协调的3D增强子架构在CD4+T细胞免疫基因调控中的核心作用。研究发现，增强子环的形成由CTCF和活跃转录（特别是STAT5驱动的超增强子活性）共同促进。稳健的增强子-启动子互作与RNAPII的暂停释放密切相关，并依赖于CTF介导的3D基因组组织来确保免疫相关基因的正确表达。CTCF不仅作为架构蛋白维持增强子环，还作为绝缘子防止增强子错误激活非特异性基因。重要的是，CTCF缺失通过重构STAT5增强子网络，而非改变上游信号传导，改变了细胞对JAK抑制剂的转录应答，揭示了3D基因组结构在细胞信号整合和药物应答中的新型调控机制。该研究深化了对三维基因组如何整合转录因子信号以精确调控细胞身份的理解，并为通过干预3D基因组结构来调节免疫反应和治疗自身免疫疾病提供了新的思路和潜在靶点。
