《ACS Applied Materials & Interfaces》：Analyzing the Relationship between Solid-Phase Molecular Presentation and Cell Proliferation, Morphology and Secretion Using CellStudio
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本文介绍了一种名为CellStudio的微珠基微系统，该平台通过结合细胞图案化与局部生物传感，实现了对细胞分泌物的空间分辨监测。研究团队进一步扩展其功能，利用微珠作为分子载体，探究了成纤维细胞生长因子2（FGF-2）的固相呈递如何影响间充质干细胞（MSCs）的行为。研究证实，通过调控FGF-2功能化微珠的比例，可精确控制局部刺激剂量，并诱导细胞发生剂量依赖性的增殖、形态重塑及血管内皮生长因子（VEGF）分泌上调。该平台为研究细胞-微环境相互作用提供了多功能、高通量的分析工具，在再生医学、药物筛选及基础细胞生物学领域具有广阔应用前景。
CellStudio平台：一种结合细胞图案化与局部生物传感的微珠基微系统
CellStudio是一种创新的细胞分析平台，旨在克服传统细胞培养技术的局限性。传统方法通常无法模拟体内复杂的细胞微环境，尤其是在控制分子线索的空间呈递方面。CellStudio通过将细胞图案化与局部生物传感功能整合，为研究细胞-微环境相互作用提供了强大的工具。
该平台的核心在于其独特的基底设计。基底由数百个独立的细胞簇组成，每个细胞簇被微珠环绕。这种配置实现了对细胞粘附、分布和细胞间接触的精确控制。更重要的是，这些微珠可以被功能化，既可以作为生物受体直接捕获和分析细胞分泌的分子（如细胞因子、生长因子），也可以作为分子载体，用于呈递特定的信号分子（如生长因子）。这种模块化设计使得研究人员能够在一个平台上同时进行刺激（呈递）和响应（检测）的分析，从而更准确地揭示细胞行为与分子信号之间的关系。
利用印刷与真空光刻技术（PnVlitho）制备CellStudio基底
CellStudio基底的制备采用了印刷与真空光刻技术（PnVlitho），该技术结合了微接触印刷和真空驱动光刻，能够精确地定制细胞培养基底。
制备过程首先通过微接触印刷在玻璃基底上形成蛋白质点阵列，这些蛋白质点（如纤连蛋白）定义了细胞粘附的区域。随后，利用真空驱动光刻技术将功能化的微珠定位在蛋白质点周围。具体而言，将含有通道状结构和均匀分布柱子的聚二甲基硅氧烷（PDMS）板与玻璃基底密封，并在真空下脱气。当释放真空时，大气压将微珠悬浮液吸入通道和柱子之间的空间，从而引导微珠围绕蛋白质点进行排列。待溶剂蒸发后，移除PDMS板，即可在玻璃表面留下被致密微珠层包围的纤连蛋白点。
这种技术能够生成由蛋白质点组成的二维图案，周围环绕着微珠的三维排列。这种配置实现了细胞粘附的精确空间控制，形成了均匀间隔的细胞簇阵列，每个细胞簇都被微珠包围，使得细胞簇能够与周围的微珠直接相互作用。扫描电子显微镜（SEM）图像证实了细胞簇的空间排列、微珠在表面的均匀分布以及细胞与微珠之间的直接物理接触。
分析间充质干细胞（MSCs）在FGF-2固相呈递下的增殖与存活
成纤维细胞生长因子2（FGF-2）是刺激间充质干细胞（MSCs）生长和增殖的关键生长因子。在CellStudio平台中，通过将FGF-2固定在微珠上进行固相呈递，可以评估不同剂量对MSCs行为的影响。
研究设计了三种微珠图案来评估不同FGF-2剂量对MSCs行为的影响。第一种配置仅包含未功能化的微珠（Blankbeads），代表无生长因子（0% FGF-2基底）。第二种配置包含Blankbeads和FGF-2功能化微珠（FGF-2beads）的1:1混合物，其中一半微珠含有生长因子（50% FGF-2基底）。第三种配置仅使用FGF-2beads，所有微珠均含有生长因子（100% FGF-2基底）。
在无血清培养基（SFM）中孵育24小时后，MSCs簇表现出不同的反应。FGF-2的存在与图案内细胞数量的显著增加和细胞形态的明显变化相关。在50% FGF-2基底中，每个阵列的细胞数量比0% FGF-2基底增加了80%。在0% FGF-2基底中，由于无血清条件，细胞脱落和死亡普遍存在。大多数50% FGF-2基底中的细胞簇（75%）每个点含有4-6个细胞，并表现出细长的形态。相比之下，0% FGF-2基底中的细胞簇大多数（66%）每个点含有2-4个细胞，显示出更圆形的形态。100% FGF-2基底则表现出过度刺激，导致细胞簇向外生长并迁移超出其原始的限制点。这些发现证实了FGF-2beads在增强MSCs增殖和存活中的作用，并突显了FGF-2对MSCs行为的剂量依赖性效应。
分析间充质干细胞（MSCs）在FGF-2固相呈递下的形态变化
FGF-2的固相呈递诱导了MSCs形态的显著变化。为了进一步研究这一点，将CellStudio 0%和50% FGF-2基底上的MSCs簇在无血清培养基（SFM）中孵育24小时，然后固定并用DAPI进行细胞核染色，用鬼笔环肽进行细胞骨架染色。
荧光成像揭示了MSCs形态的明显变化。与0% FGF-2基底相比，在50% FGF-2基底上培养的MSCs的总细胞面积增加了60%，从1150 ± 50 μm2增加到1880 ± 90 μm2。在长宽比（长度/宽度）方面也观察到显著差异，50% FGF-2基底上的MSCs表现出更高的比率（2.8 ± 0.2），而0% FGF-2基底上的MSCs为（2.0 ± 0.1），表明MSCs在响应FGF-2时伸长程度增强。观察到的细胞尺寸增大和伸长表明，通过微珠进行的局部、基底结合的FGF-2呈递触发了细胞骨架重塑和细胞铺展行为的改变。
分析间充质干细胞（MSCs）簇在FGF-2固相呈递下FGFR1的膜表达
成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）是一种膜受体，在MSCs暴露于FGF-2后数小时内即可被上调。为了扩展CellStudio的分析能力，在0%和50% FGF-2基底上标记了FGFR1，以研究生长因子如何影响受体表达。
在孵育仅5小时后，FGFR1的表达就显著增加以响应FGF-2的呈递。50% FGF-2基底中细胞簇内的荧光强度是0% FGF-2基底的两倍，证实了FGF-2对单个细胞受体产生的刺激作用。在FGF-2以可溶形式提供的传统细胞培养中，未观察到这种增加。这些结果进一步验证了FGF-2呈递对MSCs行为的影响，并突显了CellStudio通过荧光标记与固相呈递分析相结合来监测和分析细胞内事件的能力。
分析间充质干细胞（MSCs）簇在FGF-2固相呈递下的VEGF分泌
CellStudio不仅能够使用功能化有特定信号分子的微珠使细胞暴露于直接刺激，还可以使用功能化有生物受体（如抗体）的微珠直接捕获、检测和分析每个细胞簇附近的细胞分泌。血管内皮生长因子（VEGF）是一种诱导血管生成和血管发生的生长因子，在伤口愈合和组织重塑中起着关键作用。FGF-2和VEGF是调节细胞粘附、生长和增殖的关键微环境信号。
CellStudio的模块化特性使得能够将刺激和传感方法相结合，研究一种因子的固相呈递如何影响另一种因子的分泌。研究利用精确的MSCs图案化，建立了两种不同的微珠配置。第一种配置包含Blankbeads和抗VEGF IgG功能化微珠（anti-VEGFbeads）的1:1混合物，代表无生长因子（0% FGF-2基底）。第二种配置包含FGF-2beads和anti-VEGFbeads的1:1混合物（50% FGF-2基底）。
结果证实了MSCs对FGF-2功能化微珠的显著细胞反应。这包括细胞增殖和存活的增加，50% FGF-2基底在测定结束时的细胞计数比0% FGF-2基底高80%，再次证实了FGF-2暴露对单个细胞簇的刺激作用。此外，VEGF分泌的分析揭示了FGF-2的存在与VEGF释放增强之间的强相关性。暴露于FGF-2的细胞簇周围的平均荧光强度比未处理的MSCs高735 ± 30%，清楚地证明了FGF-2对VEGF分泌调节的直接影响。虽然FGF-2功能化微珠的存在导致了更多VEGF分泌细胞，但VEGF分泌的显著增加表明FGF-2刺激也可能在单个细胞水平上上调VEGF的产生。
结论
CellStudio是一个多功能平台，可用于对数百个独立细胞簇进行空间分辨的细胞分泌分析。表面图案化能够精确控制细胞间相互作用，而定位在每个细胞簇周围的微珠能够有效捕获和量化分泌的分子，如VEGF。本研究通过整合功能化有生长因子的微珠扩展了CellStudio的功能，使得能够在图案化细胞附近进行固相呈递。通过混合不同的微珠类型，可以调整呈递的生长因子的局部量，同时传感微珠并行运行，建立了一个简单的“呈递与测量”框架。这种方法改善了对细胞微环境的控制，并为研究局部刺激如何影响细胞行为提供了一种实用的方法，从而带来更准确的实验结果。
使用FGF-2刺激MSCs的模型，研究证明了可以在CellStudio内对数百个独立细胞簇实现受控的FGF-2固相呈递，从而允许对细胞行为进行多方面的分析。这种方法被证明比传统的体外测定更有效，因为它改善了细胞与生长因子之间的相互作用。此外，研究还证明了CellStudio如何能够分析一种生长因子的相互作用如何影响另一种因子的分泌，提供了在传统细胞分泌分析技术中未曾达到的灵敏度和控制水平。
除了能够精确控制细胞相互作用外，CellStudio还因其简单的制备以及与标准细胞培养和显微镜技术的兼容性而脱颖而出。这种易用性降低了技术门槛，使其适用于生物学实验室的常规使用。其有效性和适应性已通过已建立的模型得到验证。未来的工作应将其应用扩展到其他细胞类型，并通过改进图案设计、表面化学和微珠多样性来增强其功能性。
