《ACS Omega》：Systematic Modeling and Identifiability Analysis of 2,3-Butanediol Biosynthesis by Metabolically Engineered Klebsiella oxytoca Using Glucose/Xylose Cosubstrates
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本综述系统构建了代谢工程改造产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）KMS006菌株利用葡萄糖和木糖发酵生产2,3-丁二醇（2,3-BDO）的动力学模型。研究通过整合修正的Monod模型和Luedeking-Piret方程，成功描述了微生物生长、底物消耗及代谢产物（2,3-BDO、琥珀酸、乙酸）形成的动力学过程。采用随机和确定性模拟相结合的方法，通过最小二乘优化算法进行模型校准，并对18个动力学参数进行了灵敏度和可识别性分析，验证了模型的稳健性和预测可靠性。该研究为木质纤维素水解液规模化生产2,3-BDO提供了重要的过程优化和代谢工程工具。
引言
对可持续能源解决方案日益增长的需求，加强了对替代性生物基燃料和化学品的研究，以替代石油衍生产品。在众多新兴化学品中，生物基2,3-丁二醇（2,3-BDO）因其在化妆品、制药、橡胶、燃料和树脂等领域的广泛应用而受到关注。其作为平台化学品的潜力，源于其能够作为甲基乙基酮（MEK）、1,3-丁二烯、替代性生物航空燃料和各种聚合物的前体。通过发酵进行的2,3-BDO微生物生物合成，为传统的石油化学方法提供了一种可再生且具有成本效益的替代方案。
在众多用于2,3-BDO生物合成的微生物中，代谢工程改造的产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）KMS006菌株已显示出高效的生产能力。然而，尽管菌株开发取得了显著进展，但由于微生物生长、底物利用和副产物形成动力学的复杂性，实现一致且可扩展的2,3-BDO生产仍然具有挑战性。解决这些挑战需要能够准确模拟发酵过程并优化生产条件的数学和动力学模型。
材料与方法
本研究使用的微生物是代谢工程改造的产酸克雷伯菌KMS006（ΔadhEΔpta-ackAΔldhA）。分批发酵在5升生物反应器中进行，工作体积为2.5升，控制温度为37°C，搅拌速度为400 rpm，pH为6.0。葡萄糖和木糖的浓度根据实验而变化。在共利用实验中，葡萄糖和木糖的总浓度固定为100 g/L。
本研究开发了一个综合动力学模型，该模型修改自Monod动力学，并整合了Luedeking-Piret方程。模型假设发酵罐中的发酵液充分混合，pH、温度、通气和搅拌得到有效控制。高浓度的底物会直接抑制细胞生长，高浓度的终产物（琥珀酸、乙酸和2,3-BDO）也会影响细胞生长、产物形成和底物消耗。假设K. oxytoca KMS006不表现出碳分解代谢抑制（CCR），从而能够同时利用葡萄糖和木糖。
对于单底物发酵，细菌细胞生长速率基于修改的Monod方程描述，考虑了底物抑制和产物抑制。产物形成速率使用Luedeking-Piret模型描述，区分了与生长相关和非生长相关的产物形成。底物消耗速率基于细胞生长速率、维持系数以及终产物和生物量的产率来描述。
对于共底物发酵模型，引入了23个参数来捕捉发酵过程的复杂动力学。一个新关键参数kappa被引入作为底物偏好系数，用于调节葡萄糖和木糖之间的全局比生长速率。
参数估计通过结合随机和确定性方法的混合全局-局部优化策略实现。首先使用模拟退火算法随机探索有界参数空间，然后使用基于梯度的约束非线性优化器进行细化。进行了灵敏度分析和可识别性分析，以评估参数可靠性并确保模型的稳健预测。
结果与讨论
K. oxytoca KMS006的2,3-BDO生产发酵动力学
在葡萄糖发酵实验中，随着底物浓度的增加，2,3-BDO产量相应增加。然而，当葡萄糖浓度升高至300 g/L时，观察到底物抑制，产量和生产率下降。比生长率与葡萄糖浓度之间存在明显相关性，当葡萄糖浓度超过40 g/L时，出现底物抑制。在木糖发酵中，菌株也能有效地将木糖转化为2,3-BDO，但过高的木糖浓度可能引入生理压力，影响发酵性能。
产物抑制实验证实，终产物浓度显著影响比生长率。发现导致KMS006菌株停止生长的2,3-BDO、乙酸和琥珀酸的临界浓度分别为72、15和85 g/L。
动力学建模
成功构建了描述KMS006菌株在葡萄糖和木糖培养基中发酵行为的数学模型。模型预测与实验数据高度一致。该模型采用Luedeking-Piret框架来区分与生长相关和非生长相关的产物形成。维持系数和细胞裂解常数也被纳入模型，以模拟从指数期的快速、生长相关代谢物生物合成到稳定期和衰亡期的较慢、非生长相关生产的转变。
估计参数的参数灵敏度和可识别性分析
灵敏度分析用于识别最有影响力的参数。对于葡萄糖和木糖发酵，μmax、βBDO和mBDO均被确定为高度敏感的参数。通过计算灵敏度度量对参数进行排名，并对高灵敏度参数进行了重新估计，重新估计的值与初始估计值非常接近，表明先前的模型预测已经是稳健的。
使用 collinearity index 和 determinant measure 来识别具有稳健确定性和良好条件可识别性的参数子集。对于葡萄糖发酵，排名最高的参数子集包括YBDO/Glu、YX/Glu、αBDO和βBDO。对于木糖发酵，关键参数子集为YBDO/Xy、YACE/Xy、αSUC和mBDO。
基于单底物模型的共底物发酵动力学建模
研究预测了K. oxytoca KMS006的共底物利用行为，以评估使用木质纤维素水解液作为发酵原料的可行性。模型通过将先前开发的单个葡萄糖和木糖模型与相同的底层方程相结合来创建，引入了底物偏好系数来量化菌株对葡萄糖相对于木糖的偏好。
在总浓度为100 g/L（葡萄糖75 g/L，木糖25 g/L）的共底物混合物下，菌株实现了高水平的2,3-BDO生产，并完全消耗了两种糖，证明了有效的同步底物利用。模型预测与实验数据密切吻合，证实了模型捕捉混合底物利用相关复杂动力学的能
