吡哆醛5′-磷酸席夫碱衍生物的振动光谱分析及其在ω-转氨酶催化机制研究中的意义

《The Journal of Physical Chemistry B》：A Vibrational Analysis of Pyridoxal 5′-Phosphate Derivatives: Pyridoxal 5′-Phosphate-isopropylamine and Pyridoxal 5′-Phosphate-(S)-1-phenylethylamine

本综述系统阐述了两种关键吡哆醛5′-磷酸（PLP）外部醛亚胺模型化合物——PLP-异丙胺（PLP-IPAm）和PLP-(S)-1-苯乙胺（PLP-PEA）的合成、表征及振动光谱（ATR-IR、FT-Raman、INS）分析。结合单分子DFT计算，研究精准指认了其指纹区特征振动模式，揭示了PLP辅因子在转氨反应中的分子相互作用，为利用振动光谱（如拉曼光谱）实时监测PLP依赖的ω-转氨酶（ω-TAm）催化过程（如手性胺药物合成）奠定了方法学基础。

　　

2. 实验部分

2.1. PLP-IPAm的合成

在氮气保护下，将吡哆醛5′-磷酸一水合物（PLP）与等当量的异丙胺（IPAm）在无水甲醇中，于室温下反应24小时。反应体系加入活化的4?分子筛以脱水。反应结束后，过滤并真空干燥，得到PLP-IPAm黄色固体，产率高达95%。

2.2. PLP-PEA的合成

采用类似的缩合程序，将PLP与等当量的(S)-1-苯乙胺（PEA）在无水甲醇中反应，同样使用分子筛脱水，得到PLP-PEA黄色固体，产率为87%。

2.3. 核磁共振（NMR）波谱

两种化合物的¹H、¹³C和³¹P NMR谱图在氘代二甲基亚砜（DMSO-d₆）中测定，确认了产物的高纯度。

2.4. 振动光谱

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  非弹性中子散射（INS）光谱：在20 K下使用TOSCA谱仪测量，有效范围400–2000 cm^–1，对氢原子振动高度敏感。
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  衰减全反射红外（ATR-IR）光谱：在400–4000 cm^–1范围内测定，分辨率为4 cm^–1。
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  傅里叶变换拉曼（FT-Raman）光谱：使用1064 nm激发波长，在400–4000 cm^–1范围内测定，分辨率为4 cm^–1，近红外激光可有效避免荧光干扰和样品加热。

2.5. 从头算DFT计算与振动指认

使用Gaussian 09W软件包，采用B3LYP泛函和6-311G++(d,p)基集，对PLP-IPAm和PLP-PEA的单分子模型进行几何结构优化和简谐振动频率计算。计算得到的振动频率和强度用于生成模拟的INS、IR和Raman光谱，并通过GaussView软件可视化原子位移，辅助实验光谱的指认。采用“近似描述性”方法对耦合的振动模式进行归属。

3. 结果与讨论

3.1. PLP-IPAm和PLP-PEA的合成

通过优化合成条件（使用1当量胺、分子筛脱水、高真空干燥），成功制备了克级高纯度PLP-IPAm和PLP-PEA，满足了后续振动光谱分析（尤其是需要大量样品的INS测试）的需求。

3.2. 通过INS验证从头算DFT结果

粉末X射线衍射（PXRD）证实两种样品均为无定形态，无法进行周期性DFT计算。因此，采用单分子DFT模型。通过比较实验与模拟的INS光谱（图1，图2），发现二者在峰位和相对强度上高度一致，验证了DFT计算数据的可靠性，为后续光学振动光谱的指认提供了坚实基础。INS光谱清晰显示了与分子中富氢部分相关的振动：PLP-IPAm的甲基振动信号更强，而PLP-PEA则显示出复杂的苯环振动特征。

3.3. PLP-IPAm和PLP-PEA的ATR-IR光谱分析

两种化合物的ATR-IR光谱在指纹区显示出高度相似性，反映了其共同的PLP骨架结构（图4，表1）。

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  磷酸基团振动：在~492-497 cm^–1（O-P-O弯曲）、~834-836 cm^–1（O-P-O对称/不对称伸缩）和~1021-1028 cm^–1（P-OH弯曲）处观察到特征峰，这些模式可能与酶活性中心内的氢键相互作用相关。
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  吡啶环和C-H振动：在~632-764 cm^–1（面外变形）、~1155 cm^–1（PLP-IPAm，吡啶环伸缩/面内变形）、~1264 cm^–1（PLP-PEA，吡啶环伸缩/面内变形）和~1627-1628 cm^–1（吡啶环伸缩）处有特征信号。
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  化合物特异性差异：
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    PLP-PEA：在1688 cm^–1处观察到清晰的ν(C=N)亚胺键伸缩振动峰。此外，其光谱还包含一系列单取代苯环的特征振动模式（如M₁₈(b₁), M₁₇(b₁)等）。
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    PLP-IPAm：其ν(C=N)模式在ATR-IR光谱中缺失，DFT计算推测可能由于分子内氢键导致该峰宽化或减弱。在2971 cm^–1处出现的异丙基甲基不对称伸缩振动峰是其区别于PLP-PEA的标志性特征。

3.4. PLP-IPAm和PLP-PEA的FT-Raman光谱分析

FT-Raman光谱同样揭示了共同的结构框架和独特的分子特征（图5，表2）。与ATR-IR相比，FT-Raman在高频伸缩区（2800-3100 cm^–1）提供了更清晰、分辨率更好的信号。

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  共享的低频模式：包括~845-854 cm^–1（O-P-O伸缩）、~1030 cm^–1（P-OH弯曲）、~1375-1376 cm^–1（甲基对称弯曲/苯环伸缩）、~1404-1406 cm^–1（CH₂摇摆/甲基弯曲）、~1553-1554 cm^–1（吡啶环伸缩）和~1626-1627 cm^–1（吡啶环伸缩）。
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  独特的低频模式：
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    PLP-IPAm：在950 cm^–1处有异丙基甲基摇摆振动。
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    PLP-PEA：在619 cm^–1（M₂₉(b₂)面外变形）、794 cm^–1（M₁₀(a₁)面内变形）、1002 cm^–1（甲基摇摆/苯环呼吸振动）和1688 cm^–1（ν(C=N)）处显示出苯环特有的强特征峰。ν(C=N)在拉曼光谱中的出现进一步确认了其作为PLP-PEA诊断性标志的可靠性。
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  高频伸缩区模式：
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    共享的脂肪族C-H伸缩：在~2873-2884 cm^–1（次甲基CH伸缩）、~2925-2928 cm^–1（甲基对称伸缩/亚甲基对称伸缩）和~2975-2979 cm^–1（甲基不对称伸缩/亚甲基不对称伸缩）处观察到峰群。PLP-IPAm在2925 cm^–1处的峰强度显著高于PLP-PEA，可能与异丙基额外的甲基贡献有关。
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    PLP-PEA特有的芳香族C-H伸缩：在3062 cm^–1处出现强峰，归属于苯环的C-H伸缩振动（M₁(a₁), M₂(a₁)等），是芳香环存在的明确证据。
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  关于O-H伸缩的说明：DFT计算预测了高于3800 cm^–1的强O-H伸缩峰，但实验光谱中未观察到，这可能是由于无定形样品中氢键相互作用导致峰位红移和宽化，以及探测器在该波数范围灵敏度下降所致。

4. 结论

本研究成功合成了PLP-IPAm和PLP-PEA两种模型外部醛亚胺，并通过结合DFT计算与多种实验振动光谱（INS, ATR-IR, FT-Raman）技术，完成了其全面的振动光谱指认。研究确立了能够区分不同PLP衍生物的结构诊断性振动标志物，例如PLP-PEA在1688 cm^–1的ν(C=N)峰和3062 cm^–1的芳香C-H伸缩峰，以及PLP-IPAm在2971 cm^–1附近的甲基伸缩振动。FT-Raman光谱在解析高频区方面展现出优势。所建立的振动光谱指认数据库为未来利用振动光谱（尤其是适用于水相体系的拉曼光谱）原位监测PLP依赖的转氨酶催化过程（例如在手性胺药物合成中）提供了一个坚实的平台。研究表明，检测限估计在100–500 μg量级，具备应用于实际催化体系监测的潜力。