《Applied Food Research》：Study on the Extraction and Purification of Polysaccharides from Sugarcane Leaves by Ultrasound-Assisted Enzymatic Hydrolysis and the Antioxidant Activity
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本综述推荐一篇关于甘蔗叶高值化利用的研究。文章系统优化了超声辅助酶解提取（UAEE）工艺，获得高产率（4.31%）的低分子量多糖组分（P-1, 15 kDa；P-2, 9.6 kDa），并通过结构表征（HPGPC、HPAEC-PAD）揭示了其单糖组成差异。研究重点评估了多糖的体外抗氧化活性（DPPH·、·OH清除能力、铁还原力（FRAP）），证实其具有剂量依赖性，为开发功能性食品和药品的天然抗氧化剂提供了新策略。
引言
对食品、制药和化妆品行业中天然抗氧化剂的需求日益增长，使得开发丰富、高效且成本效益高的抗氧化剂来源成为研究重点。甘蔗叶是全球制糖业的巨大副产物，是一种未被充分利用的资源。在2024-2025生产季，中国的甘蔗叶产量达到9300万吨。尽管在某些文化中传统上被用作具有解毒特性的草药茶，但绝大多数甘蔗叶在田间焚烧或用于低价值发电。这种常见做法不仅导致温室气体排放，也是对宝贵自然资源的巨大浪费。因此，开发甘蔗叶的高价值应用具有重要意义。
甘蔗叶富含多种生物活性成分，包括多糖、黄酮类化合物和多酚。其中，源自甘蔗叶的多糖因其多样的生物活性而受到相当多的关注，包括抗氧化、抗糖尿病和抗肿瘤特性。然而，这些有价值化合物的提取具有挑战性。传统方法如热水提取（HWE）和酸碱提取通常存在效率低、处理时间长以及生物活性结构可能降解的问题。
为了克服这些限制，现代绿色提取技术被开发出来。例如，超声辅助提取（UAE）利用空化效应破坏细胞壁，增强传质并提高得率。同时，酶法提取提供了一种高度特异性和温和的降解细胞壁的方法。这两种方法的结合，即超声辅助酶解提取（UAEE），提供了强大的协同效应。该技术被认为是一种绿色技术，因为它在温和条件下（例如，较低温度和较短时间）操作，使用水作为良性溶剂，并采用可生物降解的酶，从而减少了能源消耗和环境影响。
近期文献的关键分析表明，通过常规或微波辅助方法获得的甘蔗叶多糖通常是高分子量聚合物（通常 >90 kDa），结构多样性有限，主要由葡萄糖、木糖和阿拉伯糖组成。因此，我们工作的关键创新在于证明优化的UAEE不仅仅是一种替代提取方法，而且是从这种生物质中生产不同类别多糖的靶向方法。我们确定，我们的工艺优先产生低分子量（9.6–15 kDa）、结构异质的多糖，其特征是尿酸含量高和单糖谱广。
基于此前提，我们假设超声空化和酶切的协同作用不仅能最大化提取得率，还能特异性产生这些独特的低分子量甘蔗叶多糖。我们进一步预测这些独特的结构特征——较低的分子量和更大的组成多样性——将赋予强大的体外抗氧化活性，从而为甘蔗叶的价值化创造一条新途径。本研究的目的在于：（1）使用响应面法（RSM）优化甘蔗叶多糖的UAEE工艺；（2）将优化得率与传统方法进行比较；（3）分离并初步表征所得多糖；（4）评估其体外抗氧化特性。
实验材料
材料与试剂
实验所用甘蔗叶购自广西崇左市场，由广西中医药大学的谭勇教授鉴定。将新鲜甘蔗叶洗净后，于80°C烘箱中放置48小时去除水分。将干燥的叶子粉碎成粉末并通过40目筛。脱脂过程采用石油醚（沸点60-90°C）在80°C水浴中按料液比1:10搅拌回流两次，每次1小时。脱脂后的粉末干燥储存备用。
葡萄糖标准品（CAS: 50-99-7）购自国药集团化学试剂有限公司（上海，中国）。用于酶法提取的纤维素酶（源自黑曲霉）、果胶酶（源自黑曲霉）和蛋白酶（源自地衣芽孢杆菌）购自上海源叶生物科技有限公司（上海，中国）。其他试剂如氯化钠、氢氧化钠、苯酚、无水乙醇、聚酰胺粉等均购自国药集团。浓硫酸（98%）由廉江市爱联化学试剂有限公司（广东廉江）提供。DEAE-52纤维素和葡聚糖凝胶（Sephadex G-100）购自上海源叶生物科技有限公司。
仪器与设备
实验使用的主要仪器包括电子天平（上海越平科学仪器制造有限公司）、超声清洗机（深圳市捷盟清洗设备有限公司）、自动平衡离心机（金坛市医疗仪器厂）、紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）、高效液相色谱仪（美国Waters公司）、真空干燥箱（上海力辰邦西仪器技术有限公司）和全波长酶标仪（美国Thermo Scientific公司）。
葡萄糖标准曲线制备
采用苯酚-硫酸法绘制葡萄糖标准曲线。精确称取2.5 mg葡萄糖标准品，用蒸馏水溶解并定容至25 mL，得到0.1 mg/mL的标准储备液。分别吸取0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.6 mL储备液（对应葡萄糖含量10, 20, 30, 50, 60 μg），用蒸馏水补足至1.0 mL。加入1.0 mL 5%苯酚溶液和5.0 mL浓硫酸，涡旋混匀后避光放置20分钟，于490 nm波长下测定吸光度。以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标，得到线性回归方程。
甘蔗叶多糖定量分析
精确称取1.0 g甘蔗叶粉末，在特定实验条件下提取多糖。离心后收集上清液，采用上述苯酚-硫酸法测定多糖含量。多糖得率（Y）按公式计算：Y (%) = [(c × V) / (m × 1000)] × 100，其中c为根据标准曲线确定的多糖浓度（mg/mL），V为提取溶剂总体积（mL），m为干甘蔗叶粉末初始质量（g）。因子1000用于将物料质量从克转换为毫克，确保量纲一致。
酶种类的确定
在参考大量文献的基础上，评估了蛋白酶、纤维素酶和果胶酶对甘蔗叶多糖提取的影响，以水作为空白对照。设定料液比为1:45，加入pH 6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。在30°C、480 W功率下超声提取30分钟。随后将混合物加热至90°C并保持5分钟以灭酶，然后在4500 rpm下离心10分钟。收集上清液，用苯酚-硫酸法测定吸光度并计算多糖得率。
单因素实验
为确定响应面优化的参数范围，进行了单因素实验：
- 1.
酶用量影响：固定料液比1:45，pH 6.0，30°C，480 W超声30分钟，考察不同酶用量（1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0%）对得率的影响。
- 2.
超声时间影响：固定酶用量3%，料液比1:30，pH 6.0，30°C，480 W，考察不同超声时间（15, 20, 25, 30, 35分钟）的影响。
- 3.
料液比影响：固定酶用量3%，超声时间30分钟，30°C，480 W，考察不同料液比（1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45）的影响。
- 4.
超声温度影响：固定酶用量3%，料液比1:45，pH 6.0，超声时间30分钟，480 W，考察不同超声温度（40, 45, 50, 55, 60°C）的影响。
响应面法（RSM）优化提取工艺
为进一步验证结果并促进优化工艺在实际生产中的应用，采用响应面法（RSM）优化提取工艺。以多糖得率（Y）为响应值，采用中心复合设计（CCD），涉及三个因素：酶用量（A）、料液比（B）和超声时间（C）。设计中心点重复五次以提供可靠的纯实验误差估计。
结果与讨论
葡萄糖标准曲线
通过苯酚-硫酸法得到的葡萄糖标准曲线回归方程为 y = 0.1831x + 0.2118，决定系数（R2）为 0.9994，表明在测试浓度范围内具有优异的线性关系。
酶种类的确定
结果显示，在最佳反应条件（3%酶用量，pH 6.0，30分钟超声提取，30°C）下，纤维素酶处理诱导的多糖得率最高，显著优于果胶酶和蛋白酶处理。经ANOVA证实，纤维素酶处理组的多糖得率显著高于其他酶处理组（p < 0.05）。因此，选择纤维素酶作为后续所有优化实验的主要用酶，以最大化多糖回收效率。
提取单因素实验
四个关键参数对多糖得率的影响结果总结如下：
- •
酶用量：多糖得率与酶用量呈抛物线关系，在4%时达到峰值后下降。这表明虽然纤维素酶能有效破坏细胞壁释放多糖，但过高的酶浓度可能导致聚集，降低催化效率。
- •
超声时间：得率随超声时间增加至30分钟，之后开始下降。初始增加归因于超声空化增强的传质作用。随后的下降可能是由于长时间暴露于强烈超声能量导致多糖链降解。
- •
料液比：得率随溶剂体积增加而增加，在料液比高于1:30 (mL/g)时趋于稳定。这表明需要足够的溶剂体积以确保完全溶解并克服浓度梯度限制。
- •
超声温度：在测试范围（40–60°C）内，温度影响相对较小，在50°C附近有轻微峰值。为避免较高温度下可能的酶失活或多糖降解，选择45°C作为后续RSM实验的适中温度。
基于单因素结果，RSM优化的中心点设定为酶用量4%、超声时间30分钟、料液比1:30。
响应面法优化提取工艺
通过Design Expert 12软件对实验数据进行二次多项式回归拟合，构建了描述多糖得率（Y）与三个自变量（酶用量A、料液比B、超声时间C）关系的三元二次回归方程：Y = 3.81 + 0.5625A + 0.6000B - 0.0050C + 0.0450AB - 0.0550AC + 0.0750BC - 0.4610A2 - 0.3760B2 - 0.2110C2。
方差分析（ANOVA）表明该模型高度显著（p = 0.0003），失拟项不显著（p = 0.5233），证实了模型的有效性。高决定系数（R2 = 0.9643）和调整R2（0.9184）表明实验值与预测值之间存在极好的相关性。
ANOVA结果清晰显示了各因素的影响。酶用量（A）和料液比（B）的线性项均高度显著（p < 0.0001），表明它们是多糖得率的主要驱动因素。相比之下，超声时间（C）的线性项不显著（p = 0.9447），表明在20-40分钟的优化范围内，其对比其他两个变量对得率的直接线性影响最小。F值比较确认影响顺序为：料液比（B）> 酶用量（A） >> 超声时间（C）。这一统计结果符合逻辑，因为一旦超声处理充分破坏了植物细胞壁结构以允许酶接触，多糖释放速率就主要取决于酶浓度（因素A）和由溶剂体积决定的传质效率（因素B）。
根据响应面分析，拟合模型确定的最佳条件为酶用量4.78%、料液比1:24.78、超声提取时间38.94分钟，预测得率为4.20%。将数值修约为酶用量（4.8%）、料液比（1:25）和超声时间（39分钟）后，三次平行实验得到的得率为4.31% ± 0.08%，与预测值一致（P > 0.05）。预测值与实验值之间的误差约为0.47%，该值极低，证实了模型的可靠性。
本研究中优化的4.31%得率相较于应用于甘蔗叶的其他方法有显著提高。例如，它远高于Zhao等人报道的单独使用UAE的1.96%得率。这种显著增强可归因于UAEE的协同机制。超声空化产生的强烈物理力（包括微射流和冲击波）物理侵蚀和破坏甘蔗叶细胞壁的顽固木质纤维素结构。这种破坏增加了植物材料的孔隙率和表面积，从而大大增强了纤维素酶对底物的可及性。因此，纤维素酶可以更有效地水解细胞壁成分，导致更完全地释放细胞内多糖。物理破坏和靶向酶水解之间的协同作用是优化的UAEE工艺性能优异的关键机制原因。
为突出优化UAEE工艺的有效性，比较了使用不同提取方法从甘蔗叶中提取多糖的得率。优化后的UAEE方法提供的得率显著高于传统HWE和单独的UAE。4.31%的得率是先前优化UAE研究实现的1.96%的两倍多，是传统HWE得率的三倍多。这定量证实了优化后的UAEE工艺在从甘蔗叶中提取多糖方面具有卓越的效率和协同效应。
甘蔗叶多糖的分离与纯化
DEAE-52纤维素离子交换柱色谱
粗多糖经DEAE-52纤维素柱分离后分为三个主要组分。中性多糖组分P-1直接用去离子水洗脱，洗脱体积在20–100 mL之间出现。随后用NaCl梯度洗脱出两个酸性多糖组分。主要的酸性组分P-2用0.1 M NaCl洗脱（洗脱体积150 – 250 mL），而次要酸性组分P-3用0.3 M NaCl洗脱（洗脱体积300–400 mL）。鉴于P-3的吸光度和得率非常低，未收集用于进一步分析。分别收集P-1和P-2组分用于进一步纯化。
Sephadex G-100凝胶过滤柱色谱
P-1和P-2组分在Sephadex G-100凝胶过滤柱上进一步纯化。两个组分均产生单一、对称的峰，表明它们成功纯化为均一多糖。对于P-1，收集洗脱体积30–80 mL对应的组分，浓缩并冷冻干燥。对于P-2，收集洗脱体积40–90 mL对应的组分。纯化后的均一多糖分别命名为P-1和P-2。
甘蔗叶多糖的初步分析
纯度与分子量测定
通过高效凝胶渗透色谱（HPGPC）测定纯度与分子量。P-1和P-2在PL aquagel-OH MIXED柱上均呈现单峰
