《Aquaculture》：Enhanced resistance to GCRV via CRISPR/Cas9-mediated SOCS3a/3b knockout in grass carp
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通过CRISPR/Cas9技术敲除草鱼socs3a和socs3b基因，构建F0代突变体。经GCRV-II浸染挑战实验，突变体存活率分别提高16.5%和12.6%，肠道及脾脏病理损伤显著减轻。分子层面检测到早期抗病毒基因ifn1、mx2表达上调，以及nf-κb2、il-6等炎症相关基因动态调控。免疫信号通路关键适配蛋白ips-1、myd88、trif表达增强，证实SOCS3通过抑制JAK-STAT通路调控免疫反应。该研究建立了草鱼抗病性评估新方法，为鱼类抗病育种提供理论依据和实用技术框架。
陈冠宇|徐月宗|王鹏旭|吕茂林|朱文涛|杨春荣|苏建国
中国华中农业大学渔业学院洪山实验站，武汉430070
摘要
疾病严重限制了水产养殖的可持续发展。通过基因编辑抑制负免疫调节因子是一种开发抗病品种的有前景策略。在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9介导的敲除技术和II型草鱼呼肠孤病毒（GCRV-II）浸染模型，建立了F0代socs3a和socs3b敲除草鱼，并系统地研究了它们的免疫反应。重要的是，基因编辑并未对敲除鱼的生长表现或其他生理指标产生不利影响。与野生型鱼相比，敲除个体在连续两年内的存活率显著提高（socs3a突变体平均提高了16.5%，socs3b突变体提高了12.6%），同时出血症状明显减轻，肠道和脾脏的组织病理损伤也有所降低。在分子水平上，敲除组在早期显著上调了关键的抗病毒基因（ifn1、mx2），并短暂增强了与炎症相关的基因（nf-κb2、il-6）的表达。值得注意的是，RLR/TLR通路中的关键适配蛋白（ips-1、myd88、trif）的表达也得到了增强，揭示了SOCS3在免疫调节中的意外作用。这种先天免疫信号的协同增强有助于显著抑制病毒转录（VP56）并减轻组织病理损伤。此外，socs3a和socs3b的敲除还增强了整体免疫细胞活性，表现为趋化性改善、白细胞凋亡增加以及巨噬细胞吞噬功能增强。我们的发现阐明了SOCS3在草鱼抗病毒免疫中的免疫调节作用，并为鱼类抗病育种提供了新的目标和早期评估方法，为可持续水产养殖发展提供了宝贵见解。
引言
作为原核生物先天适应性免疫系统的重要组成部分，规律间隔短回文重复序列及其相关系统（CRISPR/Cas）能够降解细菌病毒和质粒等外来遗传元素（Marraffini和Sontheimer，2008）。由于其高效性和靶向灵活性，CRISPR/Cas系统已成为比锌指核酸酶（ZFN）或转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）（Murovec等人，2017）更通用的基因编辑工具。其多功能性使其在功能基因组学、可持续遗传改良、疾病控制和抗病育种项目中发挥关键作用（Jinek等人，2012）。抗病性是水产养殖中的关键性状，多项研究已在个体水平上通过基因编辑免疫相关基因来研究宿主-病原体相互作用机制（Okoli等人，2022；Roy等人，2022）。张等人敲除了草鱼（Ctenopharyngodon idella）中的pik4b基因，发现F0代鱼的生长速度加快且对GCRV-II感染的抵抗力增强，证明了该基因在抵抗GCRV诱导的出血性疾病中的保护作用（Zhang等人，2025）。在大西洋鲑鱼（Salmo salar）中，Raudstein等人成功编辑了两个IgM基因，并获得了F0代鱼，进一步阐明了鲑鱼B细胞和抗体在抵御病原体感染中的作用（Raudstein等人，2025）。除了硬骨鱼类外，对脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）中的类胡萝卜素异构酶EcNinaB-X1进行基因编辑也证实了其在免疫防御中的关键作用。EcNinaB-X1敲除虾在受到Vibrio parahaemolyticus和Aeromonas hydrophila感染后，死亡率低于野生型个体（Sun等人，2020）。这些进展共同强调了针对负调控基因的靶向编辑在抗病毒和抗菌免疫中的重要性。
培育具有稳定抗病性状的个体依赖于可靠负调控基因的鉴定。细胞因子信号抑制剂（SOCS）蛋白家族是Janus激酶-信号转导子和转录激活因子（JAK-STAT）通路的关键负调节因子（Lynch等人，2024）。SOCS蛋白利用保守的SH2结构域和SOCS结构域通过竞争性抑制或泛素-蛋白酶体介导的降解对细胞因子信号传导产生负反馈，从而在免疫反应中起到分子刹车的作用（Chen等人，2022；Ramachandran等人，2023）。作为该家族的关键成员，SOCS3不仅通过其SH2结构域与IL-6受体的gp130亚基结合，还通过其N端激酶抑制区域直接抑制JAK激酶（如JAK1、JAK2、TYK2），从而有效终止JAK-STAT3信号传导（Babon等人，2012；Gao等人，2018；Lynch等人，2024）。这种双重机制突显了SOCS3在IL-6、LPS及相关刺激引发的炎症中的核心作用。此外，SOCS3/STAT3信号轴已被证明可以调节多种细胞类型（包括髓系细胞、淋巴细胞和肝细胞）中的感染性和炎症性疾病的进展（Lynch等人，2024）。
在草鱼中，SOCS家族包含14个成员（如CISH、SOCS1a/b和SOCS3a/b），这些成员在感染草鱼呼肠孤病毒（GCRV）或Aeromonas hydrophila后，在免疫相关组织（如脾脏、肝脏、鳃和肠道）中表现出组织特异性和功能多样的表达模式（Xu和Su，2021）。因此，系统研究SOCS家族，特别是SOCS3，不仅将加深我们对鱼类免疫防御机制的理解，还为培育抗病品种提供宝贵见解。
作为中国淡水养殖的主要物种，草鱼在2024年的产量达到616.49万吨，位居所有养殖淡水鱼之首（中国渔业统计年鉴2025）。然而，由草鱼呼肠孤病毒（GCRV）引起的出血性疾病已成为可持续产业发展的主要限制因素，因为该病毒的传染性和致死率很高（爆发死亡率超过80%）（Liu等人，2024）。在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术生成了同时敲除socs3a和socs3b的F0代草鱼，并对其进行了GCRV-II浸染挑战。我们系统评估了存活率、病毒载量动态、组织病理损伤以及抗病毒、炎症和模式识别受体通路中免疫基因的表达情况。对原代白细胞和巨噬细胞的功能测定进一步证实了敲除基因增强了细胞免疫活性。这种综合方法不仅揭示了SOCS3在抗病毒免疫中的作用，还为评估F0代编辑鱼的抗病性提供了快速、实用的框架，为加速抗病品种的育种提供了策略。
部分摘要
socs3a和socs3b突变草鱼的目标gRNA设计与构建
草鱼socs3a（GenBank登录号MT925699）和socs3b（GenBank登录号MT925700）的基因序列来自国家生物技术信息中心（NCBI）。使用在线工具CRISPRscan设计了基因敲除的目标位点（
https://www.crisprscan.org/）。特定引导RNA（gRNA）使用MEGAscript? T7转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）在体外合成，并储存在-80°C。Cas9 mRNA也在体外转录
socs3a和socs3b敲除突变体的成功生成
显微注射后，鱼被饲养了四个月，并同时进行了突变体筛选。随后，这些鱼接受了GCRV-II的浸染挑战，在21天内记录了死亡率并收集了样本（图1A）。F0代socs3a和socs3b敲除的目标位点均位于第二个外显子内。socs3a的目标序列为CTTGGAGCTGTTGAGGCCCC，socs3b的目标序列为CCCCCACCGGTACAAGACCTT（图1B）。扩增后的序列进行了测序
讨论
CRISPR-Cas基因组编辑通过实现精确的基因修饰，彻底改变了鱼类疾病的研究方式，为阐明疾病相关基因的功能、明确疾病易感/抗性的遗传基础、揭示宿主-病原体相互作用以及开发抗病品种提供了强大工具（Marnis和Syahputra，2025）。近年来，通过CRISPR/Cas9介导的敲除技术已经鉴定并靶向了几种负免疫调节因子
结论
基于建立的浸染挑战模型，本研究系统评估了F0代socs3a和socs3b敲除草鱼对GCRV-II的抗性。结果表明，基因敲除显著提高了存活率，并减轻了病毒引起的组织病理损伤。在分子水平上，socs3a和socs3b的敲除显著上调了抗病毒基因（包括ifn1和mx2）和炎症介质（nf-κb2和il-6）的表达。
CRediT作者贡献声明
陈冠宇：撰写——原始草稿、可视化、验证、研究、数据分析、数据管理。徐月宗：验证、方法学、研究。王鹏旭：验证、方法学。吕茂林：验证、研究。朱文涛：验证、数据管理。杨春荣：方法学、概念构思。苏建国：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有可能影响本研究的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢宁霞小姐、唐波先生、张静晶小姐、卢一忠先生、王世杰先生和李文星小姐在实验中的技术建议和帮助。本研究得到了“生物育种-国家科技重大项目”（2023ZD04065）的支持。
