《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Design-Driven Optimization of Mitochondrial Protein Phosphatases for
in vitro Studies
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本研究通过设计22个表达构建体，系统优化了含MTS的四个线粒体蛋白磷酸酶（PTPMT1、PP2Cm、PPTc7、PGAM5）的克隆、表达与纯化工艺。结果表明，矩阵定位酶需去除MTS并添加溶氧性标签以获得稳定、有活性的形式，而膜间定位的PGAM5虽保持活性，但MTS存在会降低表达并增加不稳定性。该研究为线粒体蛋白的体外研究提供了重要工具。
Mariana L. Gabas|Luca P. Otvos|Naira B.O. Almeida|Sofia O. Farias|Giovanna S. Val|Luciana E.S.F. Machado
圣保罗大学生物科学研究所遗传与进化生物学系，巴西05508-090
摘要：
分子克隆和异源蛋白表达对于研究蛋白质功能及其与小分子、药物和其他蛋白质的相互作用至关重要。关于线粒体蛋白磷酸酶的氧化还原调控、分子间相互作用、结构确定和结构动力学的研究需要高产量的可溶性、具有催化活性的酶。因此，本研究的目的是优化这些蛋白磷酸酶的单体和活性形式的克隆、表达及可溶性纯化。我们设计了22个表达载体，编码线粒体蛋白磷酸酶PTPM1、PP2Cm、PPTc7和PGAM5，其中包含带有或不带有线粒体靶向序列（MTS）的变体以及增强溶解性的融合标签。结果表明，对于定位于基质中的磷酸酶而言，去除MTS并结合可溶性融合标签是获得可溶性、结构稳定、正确折叠且具有催化活性的蛋白质的关键。相比之下，定位于膜间隙的PGAM5在所有载体中都具有良好的结构和活性，但MTS的存在降低了表达量并增加了蛋白质的不稳定性。总体而言，这项工作强调了合理设计载体对于成功生产适用于体外生化和结构研究的线粒体蛋白磷酸酶的重要性。
引言
线粒体蛋白磷酸酶在细胞质中合成，并含有一个N端线粒体靶向序列（MTS），该序列将其引导至线粒体，在线粒体内MTS通常会被切割，从而使蛋白质折叠成其活性构象。目前已知有十种线粒体蛋白磷酸酶，包括四种双特异性蛋白磷酸酶DUSP18、DUSP21、DUSP23（也称为线粒体蛋白酪氨酸磷酸酶PTPM1）和DUSP26；五种蛋白丝氨酸苏氨酸磷酸酶，金属依赖性的PP2Cm及其典型对应物PPTc7，丙酮酸脱氢酶磷酸酶PDP1和PDP2，以及一种组氨酸基磷酸酶PGAM5；还有一种含有5个半胱氨酸残基的卤酸脱卤酶（HAD）样水解酶结构域的蛋白质CECR5 [1], [2], [3], [4]。在大多数情况下，MTS位于N端，并在线粒体导入过程中被切割以产生稳定且功能正常的蛋白质 [5]。尽管许多这种切割过程由线粒体肽酶介导，包括线粒体加工肽酶（MPP）、八肽氨基肽酶（Oct1p）、Xaa-Pro氨基肽酶或中间切割肽酶（XPNPEP3或Icp55）、内膜加工肽酶（IMP）或线粒体菱形蛋白酶（PARL）[6], [7], [8]，但DUSP18和DUSP21的MTS位于N端区域，在导入过程中不会被切割 [2]。
PTPMT1和DUSP21锚定在线粒体面向基质的内膜上 [2], [9]，而PP2Cm、PPTc7、PDP1和PDP2位于线粒体基质中 [1], [10]，DUSP18和PGAM5则锚定在线粒体面向膜间隙的内膜上 [2], [11]。最近的研究表明DUSP26定位于线粒体外膜 [3]。这些蛋白质中，PTPM1、PP2Cm、PPTc7、PDP1和PDP2都具有MPP切割位点，而PGAM5则被PARL切割 [11]。
为了进行这些蛋白质的体外研究，去除靶向信号是必要的，以模拟其成熟的细胞形态。因此，通过异源表达系统生产蛋白磷酸酶一直是一个挑战。许多蛋白质，尤其是DUSP类蛋白质，很少能以适合体外实验的形式获得，这从有限的文献中可以看出来。2025年12月18日使用“PTPMT1”或“PP2Cm”或“PPTc7”或“PGAM5”在PubMed上进行搜索，分别得到61篇、32篇、20篇和331篇论文，其中只有1篇、1篇、0篇和大约4篇报道了体外实验。大多数这些蛋白质需要一个可溶性蛋白标签才能成功表达 [12], [13]。研究人员已经使用带有此类标签的PP2Cm进行了实验 [12]，但这些实验可能无法准确反映细胞内的实际情况。目前还没有关于人源PPTc7和PTPM1的体外实验。
线粒体蛋白磷酸酶在细胞信号传导中发挥特定作用。例如，PTPM1通过与琥珀酸脱氢酶的脱磷酸作用参与调节胰腺β细胞的氧化磷酸化和胰岛素分泌 [9], [14]；PP2Cm通过脱磷酸化磷脂酰甘油磷酸参与调节心磷脂的生物合成 [15]；PP2Cm还通过脱磷酸化支链α-酮酸脱氢酶复合物来激活支链氨基酸的氧化 [16]；PPTc7似乎通过脱磷酸化柠檬酸合酶和COQ7酶来激活三羧酸循环并调节辅酶Q10的生物合成 [17], [18]；PGAM5则从线粒体释放出来，并通过脱磷酸化FUNDC1、ASK1和Drp1参与线粒体自噬、细胞凋亡和线粒体动力学 [19], [20], [21], [22]。
鉴于线粒体蛋白磷酸酶在细胞信号传导中的重要性，本研究旨在优化人源线粒体蛋白磷酸酶PTPM1、PP2Cm、PPTc7和PGAM5的表达和纯化，以获得适合未来生化和结构实验的稳定、可溶且具有活性的形式。通过预测并去除MTS，并使用带有或不带有增强溶解性融合标签的载体来设计载体。将这些载体与全长蛋白质进行比较，发现MTS的存在会导致线粒体蛋白磷酸酶的不稳定性，而可溶性融合标签即使在没有MTS的情况下也能改善表达和纯化效果。
构建体片段
构建体
编码人源PTPM1、PP2Cm、PPTc7和PGAM5的DNA，其中包含或不包含线粒体靶向序列（MTS）（PTPM1的残基1-201和37-201，PP2Cm的残基1-372和35-372，PPTc7的残基1-304和35-304，PGAM5的残基1-289、34-289、49-289和81-289），被亚克隆到不同的载体中（pRP1B、pTHMT、pET28a_SUMO和pET28a_GST，这些载体在蛋白磷酸酶上游都含有TEV切割位点，在可溶性蛋白标签上游含有六个组氨酸标签或TEV切割位点）（表1），使用的是自制的
带有线粒体靶向信号的线粒体蛋白磷酸酶
为了优化全长PTPM11-201、PP2Cm1-372、PPTc71-304和PGAM51-289的表达，测试了多种条件，包括不同的IPTG浓度、培养温度和大肠杆菌菌株。然而，这些方法并未显著改善表达效果（数据未显示）。随后评估了带有和不带有可溶性蛋白标签的表达载体，以增强蛋白磷酸酶的产量（表1）。所有载体都包含一个组氨酸标签，以便于纯化
讨论
本研究的数据表明，位于线粒体基质中的线粒体蛋白磷酸酶PTPM1、PP2Cm和PPTc7需要去除MTS并添加可溶性蛋白标签，才能在体外实验中成功表达和纯化（图2、3）。这与已知线粒体蛋白磷酸酶在没有MTS的情况下是稳定的这一事实相符 [5], [28]。
MTS在线粒体蛋白质中的存在对于其定向至关重要
CRediT作者贡献声明
Mariana Gabas：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学设计，实验设计，数据分析。Giovanna Val：数据分析。Luciana E.S.F. Machado：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，项目监督，方法学设计，实验设计，资金申请，数据分析，概念化。Naira Almeida：方法学设计，数据分析。Sofia Farias：撰写 – 审稿与编辑
数据可用性声明
本文中引用的所有数据均作为补充图表提供。
资助
获得来自FAPESP的资助（2019/02605-3号项目）。M.L.G.获得了2022/04064-2号、2021/10474-6号和2023/02968-4号奖学金；L.P.O.获得了2021/10474-6号和2023/02968-4号奖学金；N.B.O.A.获得了2021/13213-9号奖学金；S.O.F.获得了2022/02313-5号奖学金；L.E.S.F.M获得了2020/10168-0号奖学金；G.S.V.获得了2022/2023-2022-1318号PIBIC奖学金。
致谢
我们感谢Carla Columbano de Oliveira教授允许使用由FAPESP资助购买的Emulsiflex C3（Avestin）（资助编号2020/00901-1）。本工作得到了圣保罗研究基金会（FAPESP）的2019/02605-3号项目、M.L.G.的2022/04064-2号奖学金、L.P.O.的2021/10474-6号和2023/02968-4号奖学金、N.B.O.A.的2021/13213-9号奖学金、S.O.F.的2022/02313-5号奖学金以及L.E.S.F.M的2020/10168-0号奖学金的支持，以及国家科学委员会的2022/2023-2022-1318号PIBIC奖学金的支持。
